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抗PD‑1的人抗体的专利技术

来源:未知 编辑:晚一步 时间:2017-11-23
技术领域本发明涉及特异性结合免疫调谐(immunomodulatory)受体程序性死亡-1(PD-1)的人抗体和人抗体的抗原结合片段,及使用那些抗体的治疗和诊断方法。

背景技术:
程序性死亡-1(PD-1)(也称CD279)是表达在活化T细胞和B细胞、天然杀伤细胞和单核细胞上的288个氨基酸的蛋白质受体。PD-1是CD28\/CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原)\/ICOS(诱导型共刺激物)家族T细胞共抑制受体的成员(Chen等2013,Nat.Rev.Immunol.13:227-242)。PD-1的主要功能是减弱免疫反应(Riley2009,Immunol.Rev.229:114-125)。PD-1具有两个配体,PD-配体1(PD-L1)和PD-L2。PD-L1(CD274、B7H1)广泛表达在淋巴和非淋巴组织二者如CD4和CD8T细胞、巨噬细胞谱系细胞、外周组织上,以及肿瘤细胞、病毒感染细胞和自身免疫组织细胞上。PD-L2(CD273、B7-DC)具有比PD-L1更受限制的表达,表达在活化树突细胞和巨噬细胞上(Dong等1999,NatureMed.)。PD-L1在大多数人癌症中表达,包括黑素瘤、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、头和颈鳞状细胞癌、白血病、胰腺癌、肾细胞癌和肝细胞癌,且在几乎所有癌症类型中都可以诱导(Zou和Chen2008,Nat.Rev.Immunol.8:467-77)。PD-1结合其配体导致T细胞增殖和细胞因子分泌减少,在诸如癌症、病毒感染和自身免疫病的疾病中使体液和细胞免疫反应受损。已在自身免疫、病毒和肿瘤免疫治疗中研究了阻断PD-1结合来逆转免疫抑制(Ribas2012,NEJM366:2517-2519;Watanabe等2012,Clin.Dev.Immunol.2012卷,文章ID:269756;Wang等2013,J.ViralHep.20:27-39)。T细胞共刺激和共抑制分子(统称共信号分子)在调节T细胞活化、亚型分化、效应子功能和存活中发挥至关重要的作用(Chen等2013,NatureRev.Immunol.13:227-242)。在通过T细胞受体识别抗原呈递细胞上的关联肽-MHC复合体后,共信号受体与T细胞受体共定位在免疫突触处,在免疫突触中,它们与TCR信号发放协同作用,以促进或抑制T细胞活化和功能(Flies等2011,YaleJ.Biol.Med.84:409-421)。最终的免疫反应受共刺激和共抑制信号之间的平衡调节(“免疫检验点”)(Pardoll2012,Nature12:252-264)。PD-1作为一个这种“免疫检验点”在介导外周T细胞耐受中及避免自身免疫中发挥作用。PD-1结合PD-L1或PD-L2,并抑制T细胞活化。慢性病毒感染和肿瘤利用PD1抑制T细胞活化的能力来逃避免疫反应。在慢性病毒感染中,PD-1在病毒特异性T细胞上高表达,这些T细胞变得“衰竭”,丧失效应子功能和增殖能力(Freeman2008,PNAS105:10275-10276)。PD-L1在多种肿瘤上表达,动物模型上的研究已显示,肿瘤上的PD-L1抑制T细胞活化和肿瘤细胞裂解,并可导致肿瘤特异性T细胞的死亡增加。PD-1:PD-L1系统还在诱导型T调节(Treg)细胞发育中及维持Treg功能中发挥重要作用(Francisco等2010,Immunol.Rev.236:219-242)。由于PD-1在自身免疫、肿瘤免疫和感染免疫中发挥重要作用,所以它是理想的免疫治疗靶点。已在癌症和慢性病毒感染的治疗中研究了用包括单克隆抗体的拮抗剂阻断PD-1(Sheridan2012,NatureBiotechnology30:729-730)。抗PD-1的单克隆抗体为本领域已知,并描述于例如美国专利\/公开号8008449、8168757、20110008369、20130017199、20130022595中,及WO2006121168、WO20091154335、WO2012145493、WO2013014668、WO2009101611、EP2262837和EP2504028中。发明概述本发明提供结合PD-1的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体尤其用于靶向表达PD-1的T细胞,及用于调节PD-1活性。在某些实施方案中,本发明的抗体用于抑制或中和PD-1活性和\/或用于刺激T细胞活化,例如在T细胞介导的杀伤有益或希望得到的情况下。在备选实施方案中,该抗体增强PD-1结合和\/或活性,并可用于抑制T细胞活化。本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分可以作为多特异性抗原结合分子的部分包括,例如,以调节免疫反应和\/或将该抗体靶向至特定细胞类型,如肿瘤细胞、自身免疫组织细胞或病毒感染细胞。该抗体用于治疗疾病或障碍,如癌症、病毒感染和自身免疫病。本发明的抗体可以是全长(例如,IgG1或IgG4抗体)或可以仅包含抗原结合部分(例如,Fab、F(ab’)2或scFv片段),且可以修饰以影响功能性,例如,以消除残留效应子功能(Reddy等,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。在某些实施方案中,该抗体可以是双特异性抗体。在第一方面,本发明提供特异性结合PD-1的分离的重组单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中,该抗体是全人抗体。本发明的示例性抗PD-1抗体在本文表1-3中列出。表1显示示例性抗PD-1抗体的重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)、重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识号。表2显示示例性抗PD-1抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识号。表3显示示例性抗PD-1抗体的重链和轻链序列的氨基酸序列标识号。本发明提供抗体或其抗原结合片段,其包含选自表1中所列任意HCVR氨基酸序列的氨基酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含选自表1中所列任意LCVR氨基酸序列的氨基酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR\/LCVR),该HCVR\/LCVR含有与表1中所列任意LCVR氨基酸序列配对的表1中所列任意HCVR氨基酸序列。根据某些实施方案,本发明提供抗体或其抗原结合片段,其含有包含在表1中所列任意示例性抗PD-1抗体内的HCVR\/LCVR氨基酸序列对。在某些实施方案中,该HCVR\/LCVR氨基酸序列对选自SEQIDNO:2\/10、18\/26、34\/42、50\/58、66\/74、82\/90、98\/106、114\/122、130\/138、146\/154、162\/170、178\/186、194\/202、210\/202、218\/202、226\/202、234\/202、242\/202、250\/202、258\/202、266\/202、274\/202、282\/202、290\/202、298\/186、306\/186和314\/186。在某些实施方案中,该HCVR\/LCVR氨基酸序列对选自SEQIDNO:130\/138(例如H2M7795N)、162\/170(例如H2M7798N)、234\/202(例如H4xH9048P)或314\/186(例如H4xH9008P)。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含重链CDR1(HCDR1),该HCDR1含有选自表1中所列任意HCDR1氨基酸序列的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含重链CDR2(HCDR2),该HCDR2含有选自表1中所列任意HCDR2氨基酸序列的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含重链CDR3(HCDR3),该HCDR3含有选自表1中所列任意HCDR3氨基酸序列的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含轻链CDR1(LCDR1),该LCDR1含有选自表1中所列任意LCDR1氨基酸序列的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含轻链CDR2(LCDR2),该LCDR2含有选自表1中所列任意LCDR2氨基酸序列的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含轻链CDR3(LCDR3),该LCDR3含有选自表1中所列任意LCDR3氨基酸序列的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3\/LCDR3),该HCDR3\/LCDR3含有与表1中所列任意LCDR3氨基酸序列配对的表1中所列任意HCDR3氨基酸序列。根据某些实施方案,本发明提供抗体或其抗原结合片段,其含有包含在表1中所列任意示例性抗PD-1抗体内的HCDR3\/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方案中,该HCDR3\/LCDR3氨基酸序列对选自SEQIDNO:136\/144(例如H2M7795N)、168\/176(例如H2M7798N)、240\/208(例如H4xH9048P)和320\/192(例如H4xH9008P)。本发明提供抗体或其抗原结合片段,其包含重链,该重链含有选自表3中所列任意HC氨基酸序列的氨基酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含轻链,该轻链含有选自表3中所列任意LC氨基酸序列的氨基酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其包含HC和LC氨基酸序列对(HC\/LC),该HC\/LC含有与表3中所列任意LC氨基酸序列配对的表3中所列任意HC氨基酸序列。根据某些实施方案,本发明提供抗体或其抗原结合片段,其含有包含在表3中所列任意示例性抗PD-1抗体内的HC\/LC氨基酸序列对。在某些实施方案中,该HC\/LC氨基酸序列对选自SEQIDNO:330\/331、332\/333、334\/335和336\/337。本发明还提供抗体或其抗原结合片段,其含有包含在表1中所列任意示例性抗PD-1抗体中的一组6个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施方案中,该HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列选自SEQIDNO:132-134-136-140-142-144(例如H2M7795N)、164-166-168-172-174-176(例如H2M7798N)、236-238-240-204-206-208(例如H4xH9048P)和316-318-320-188-190-192(例如H4xH9008P)。在相关实施方案中,本发明提供抗体或其抗原结合片段,其含有包含在表1中所列任意示例性抗PD-1抗体所定义的HCVR\/LCVR氨基酸序列对内的一组6个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。例如,本发明包括抗体或其抗原结合片段,其含有包含在选自SEQIDNO:130\/138(例如H2M7795N)、162\/170(例如H2M7798N)、234\/202(例如H4xH9048P)和314\/186(例如H4xH9008P)的HCVR\/LCVR氨基酸序列对内的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术为本领域公知,并可用于鉴定本文公开的指定HCVR和\/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定CDR边界的示例性惯例包括,例如,Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言,Kabat定义基于序列变异性,Chothia定义基于结构环区的位置,AbM定义是Kabat法和Chothia法之间的折衷。参见例如Kabat,\SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,\NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991);Al-Lazikani等,J.Mol.Biol.273:927-948(1997);及Martin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。公开数据库也可用于鉴定抗体内的CDR序列。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗PD-1抗体。在一些实施方案中,可以使用去除不希望得到的糖基化位点的修饰,或缺乏存在于寡糖链上的岩藻糖部分的抗体,以提高依赖抗体的细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277:26733)。在其他应用中,可以进行糖基化修饰来改变依赖补体的细胞毒性(CDC)。本发明还提供与包含HCVR的CDR和LCVR的CDR的抗体或其抗原结合片段竞争特异性结合PD-1的抗体及其抗原结合片段,其中该HCVR和LCVR各具有选自表1中所列HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。本发明还提供阻断PD-1与PD-L1或PD-L2结合的分离的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中,阻断PD-1与PD-L1结合的抗体或其抗原结合片段可以结合与PD-L1相同的PD-1上的表位,或者可以结合与PD-L1不同的PD-1上的表位。在备选实施方案中,本发明提供刺激PD-1与PD-L1结合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中,本发明提供结合PD-1的分离的抗体或其抗原结合片段,其中该抗体或其抗原结合片段增强PD-1与PD-L1的结合。在一些实施方案中,该分离的抗体或其抗原结合片段包含:HCVR的CDR,其中该HCVR具有选自SEQIDNO:2、98和250的氨基酸序列;LCVR的CDR,其中该LCVR具有选自SEQIDNO:10、106和202的氨基酸序列。在一些实施方案中,该分离的抗体或其抗原结合片段包含选自SEQIDNO:2\/10(例如H1M7789N)、98\/106(例如H2M7791N)和250\/202(例如H4H9068P2)的HCVR\/LCVR氨基酸序列对。本发明还提供特异性结合来自人或其他物种的PD-1的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中,该抗体可以结合人PD-1和\/或结合猕猴(cynomolgus)PD-1。本发明还提供与包含HCVR的CDR和LCVR的CDR的参考抗体或其抗原结合片段交叉竞争结合PD-1的抗体及其抗原结合片段,其中该HCVR和LCVR各具有选自表1中所列HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。在一个实施方案中,本发明提供具有一种或多种以下特征的分离的抗体或其抗原结合片段:(a)阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合;(b)特异性结合人PD-1和\/或猕猴PD-1;(c)阻断PD-1诱导的T细胞下调和挽救T细胞信号发放;(d)在患有结肠癌的个体中抑制肿瘤生长和增加存活期;(e)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中抑制T细胞增殖;和(f)在MLR测定中增加IL-2和\/或干扰素-γ分泌。在一些实施方案中,该抗体或其抗原结合片段可以以激动剂方式特异性结合PD-1,即它可以增强或刺激PD-1结合和\/或活性;在其他实施方案中,该抗体可以以拮抗剂方式特异性结合PD-1,即它可以阻断PD-1与其配体结合。在某些实施方案中,本发明的抗体或抗原结合片段是双特异性的,其包含对PD-1的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。该第二靶表位可以是PD-1上或不同蛋白质上的另一表位。在某些实施方案中,该靶表位可以在不同的细胞上,包括在不同的T细胞、B细胞、肿瘤细胞、自身免疫组织细胞或病毒感染细胞上。在第二方面,本发明提供编码抗PD-1抗体或其部分的核酸分子。例如,本发明提供编码表1中所列任意HCVR氨基酸序列的核酸分子;在某些实施方案中,该核酸分子包含选自表2中所列任意HCVR核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供编码表1中所列任意LCVR氨基酸序列的核酸分子;在某些实施方案中,该核酸分子包含选自表2中所列任意LCVR核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供编码表1中所列任意HCDR1氨基酸序列的核酸分子;在某些实施方案中,该核酸分子包含选自表2中所列任意HCDR1核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供编码表1中所列任意HCDR2氨基酸序列的核酸分子;在某些实施方案中,该核酸分子包含选自表2中所列任意HCDR2核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供编码表1中所列任意HCDR3氨基酸序列的核酸分子;在某些实施方案中,该核酸分子包含选自表2中所列任意HCDR3核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供编码表1中所列任意LCDR1氨基酸序列的核酸分子;在某些实施方案中,该核酸分子包含选自表2中所列任意LCDR1核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供编码表1中所列任意LCDR2氨基酸序列的核酸分子;在某些实施方案中,该核酸分子包含选自表2中所列任意LCDR2核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供编码表1中所列任意LCDR3氨基酸序列的核酸分子;在某些实施方案中,该核酸分子包含选自表2中所列任意LCDR3核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。本发明还提供编码HCVR的核酸分子,其中该HCVR包含一组3个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3),其中该HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1中所列任意示例性抗PD-1抗体所定义。本发明还提供编码LCVR的核酸分子,其中该LCVR包含一组3个CDR(即LCDR1-LCDR2-LCDR3),其中该LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1中所列任意示例性抗PD-1抗体所定义。本发明还提供编码HCVR和LCVR二者的核酸分子,其中该HCVR包含表1中所列任意HCVR氨基酸序列的氨基酸序列,其中该LCVR包含表1中所列任意LCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方案中,该核酸分子包含选自表2中所列任意HCVR核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列,及选自表2中所列任意LCVR核酸序列的多核苷酸序列,或与之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的其基本相似的序列。在本发明的此方面的某些实施方案中,该核酸分子编码HCVR和LCVR,其中该HCVR和LCVR都源自表1中所列的同一抗PD-1抗体。本发明提供编码表3中所列任意重链氨基酸序列的核酸分子。本发明还提供编码表3中所列任意轻链氨基酸序列的核酸分子。本发明还提供编码重链(HC)和轻链(LC)二者的核酸分子,其中该HC包含表3中所列任意HC氨基酸序列的氨基酸序列,其中该LC包含表3中所列任意LC氨基酸序列的氨基酸序列。在相关方面,本发明提供能够表达含有抗PD-1抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如,本发明包括重组表达载体,其包含上述任意核酸分子,即编码表1中所示任意HCVR、LCVR和\/或CDR序列的核酸分子。本发明还提供能够表达含有抗PD-1抗体的重链或轻链的多肽的重组表达载体。例如,本发明包括重组表达载体,其包含上述任意核酸分子,即编码表3中所示任意重链或轻链序列的核酸分子。已引入这类载体的宿主细胞、以及通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞并回收这样产生的抗体和抗体片段来产生抗体或其部分的方法也包括在本发明的范围之内。在第三方面,本发明提供多特异性抗原结合分子及其抗原结合片段,其包含特异性结合PD-1的第一抗原结合特异性,及特异性结合选自肿瘤细胞特异性抗原、自身免疫组织特异性抗原、感染细胞特异性抗原、T细胞共抑制物、T细胞受体、Fc受体、PD-L1和PD-1的抗原的第二抗原结合特异性。在某些实施方案中,该第一抗原结合特异性可以包含源自HCVR的三个CDR,该HCVR具有选自表1中的HCVR序列的氨基酸序列,及源自LCVR的三个CDR,该LCVR具有选自表1中的LCVR序列的氨基酸序列。在一个实施方案中,该第一抗原结合特异性可以包含PD-L1的胞外域。该第二抗原结合特异性可以靶向与PD-1相同的细胞上或同一组织类型或不同组织类型的不同细胞上的抗原。例如,该多特异性抗原结合分子可以结合T细胞,其中该第一抗原结合特异性可以特异性结合PD-1,而该第二抗原结合特异性可以结合T细胞上的T细胞受体。备选地,在另一实施方案中,该第一抗原结合特异性可以特异性结合T细胞上的PD-1,而该第二抗原结合特异性可以靶向B细胞或巨噬细胞或抗原呈递细胞上的抗原\/受体。在某些实施方案中,该第二抗原结合特异性可以针对自身免疫组织相关抗原。在一个实施方案中,该第一抗原结合特异性可以包含PD-L1的胞外域,而该第二抗原结合特异性可以结合PD-1上的另一表位。在某些实施方案中,该第一抗原结合特异性以较低亲和力特异性结合PD-1,例如以超过10-7M、超过10-6M、超过10-5M或超过10-4M的KD。在第四方面,本发明提供包含特异性结合PD-1的重组人抗体或其片段和可药用载体的药物组合物。在相关方面,本发明涉及组合物,其是抗PD-1抗体和第二治疗剂的组合。在一个实施方案中,该第二治疗剂是有利地与抗PD-1抗体组合的任意治疗剂。可以有利地与抗PD-1抗体组合的示例性治疗剂非限制性地包括:其他结合和\/或调节PD-1信号发放的治疗剂(包括其他抗体或其抗原结合片段等),和\/或不直接结合PD-1但调节免疫细胞活化的治疗剂。涉及本发明的抗PD-1抗体的其他联合治疗和共同制剂(co-formulation)在本文中其他地方公开。在第五方面,本发明提供调节个体中的免疫反应的方法,该方法包括对有需要的个体施用治疗有效量的本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中,本发明提供增强个体中的免疫反应的方法,该方法包括对该个体施用有效量的本发明的结合PD-1并阻断PD-1与PD-L1结合的抗体或其片段。在一个实施方案中,本发明提供刺激或增强个体中的T细胞刺激的方法。在一个实施方案中,本发明提供抑制个体中的T调节(Treg)细胞的方法,该方法包括对有需要的个体施用治疗有效量的本发明的阻断抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中,该有需要的个体患有诸如癌症或病毒感染的疾病或障碍。在备选实施方案中,本发明提供抑制或阻抑个体中的T细胞活化的方法,该方法包括对有需要的个体施用治疗有效量的本发明的激活抗体或其片段。在一个实施方案中,该个体可以患有自身免疫疾病或障碍。在第六方面,本发明提供用本发明的抗PD-1抗体或抗体的抗原结合部分在个体中治疗诸如癌症、自身免疫病或病毒感染的疾病或障碍的治疗方法,其中该治疗方法包括对有需要的个体施用治疗有效量的包含本发明的抗体或抗体片段的药物组合物。所治疗的障碍是通过刺激或抑制PD-1活性或信号发放而得到改善、好转、抑制或阻止的任意疾病或病症。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合对有需要的个体施用。该第二治疗剂可以选自抗另一T细胞共抑制物的抗体、抗肿瘤细胞抗原的抗体、抗T细胞受体的抗体、抗Fc受体的抗体、抗病毒感染细胞上的表位的抗体、抗自身免疫组织抗原的抗体、抗PD-L1的抗体、细胞毒剂、抗癌药、抗病毒药、抗炎药(例如糖皮质激素)、化疗剂、放疗、免疫抑制剂及本领域已知的任意其他药物或治疗。在某些实施方案中,该第二治疗剂可以是帮助对抗或减少与本发明的抗体或其抗原结合片段相关的任何可能的副作用(如果存在这类副作用)的治疗剂。在某些实施方案中,本发明提供用于抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中,本发明提供增强癌症患者的存活的方法。癌症的实例包括但不限于原发性和\/或复发性癌症,包括脑癌(例如多形性成胶质细胞瘤)、肺癌(例如非小细胞肺癌)、头和颈鳞状细胞癌、肾细胞癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌和结肠癌。该方法包括与选自血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂(例如阿柏西普(aflibercept)、贝伐单抗(bevacizumab))、血管生成素-2(Ang2)抑制剂(例如抗Ang2抗体,如nesvacumab)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抑制剂(例如伊匹单抗(ipilimumab))、化疗剂和放疗的第二治疗剂组合,施用包含治疗有效量的本发明的抗PD-1抗体的药物组合物。可以与本发明的抗PD-1抗体组合使用,用于治疗癌症的其他治疗\/治疗剂的其他实例在本文中其他地方描述。抗体或其片段可以皮下、静脉内、皮内、腹腔内、口服、肌内或颅内施用。抗体或其片段可以按约0.1mg\/kg个体体重至约100mg\/kg个体体重的剂量施用。本发明还包括本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗可从阻断或增强PD-1结合和\/或信号发放受益的疾病或障碍的药物中的用途。其他实施方案将从随后的发明详述的浏览变得显而易见。附图简述图1是本文实施例8中所述基于萤光素酶的PD-1生物测定的示意图。A:失活Jurkat细胞;图B:通过CD3xCD20双特异性抗体使T细胞受体(TCR)成簇来活化Jurkat细胞;图C:PD-1激活减弱了活化Jurkat细胞中的反应;图D:阻断PD-1挽救了活化Jurkat细胞中的反应。图2显示在第0天植入Colon-26肿瘤细胞并在第3、6、10、13和19天通过注射来用所示分子组合治疗的小鼠(“早期治疗肿瘤模型”)的肿瘤生长和存活结果。图表显示不同实验组在植入后多种时间点的肿瘤体积(mm3)。沿X轴向上的箭头指示治疗注射的时间。“mIgG2a”是IgG2同种型对照;“Fc”是人Fc对照;“VEGFTrap”是阿柏西普;“抗PD-1”是抗小鼠PD-1克隆RPMI-14;“抗PD-L1”是本文中其他地方所述的抗PD-L1单克隆抗体。图3显示在第0天植入Colon-26肿瘤细胞并在第3、6、10、13和19天通过注射来用所示分子组合治疗的小鼠(“早期治疗肿瘤模型”)的肿瘤生长和存活结果。图表显示各实验组中的单只小鼠在植入后第28天的肿瘤体积(mm3)。“mIgG2a”是IgG2同种型对照;“Fc”是人Fc对照;“VEGFTrap”是阿柏西普;“抗PD-1”是抗小鼠PD-1克隆RPMI-14;“抗PD-L1”是本文中其他地方所述的抗PD-L1单克隆抗体。发明详述在描述本方法之前,应理解,本发明不限于所描述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应理解,本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的,并非旨在限制,因为本发明的范围将仅受限于所附权利要求。除非另有定义,本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。虽然与本文中所述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于实施或测试本发明,但现在描述优选的方法和材料。本文中提到的所有出版物在此以其整体引入作为参考。术语“PD-1”指T细胞共抑制物程序性死亡-1蛋白质,也称为CD279。全长PD-1的氨基酸序列在GenBank中作为检索号NP_005009.2提供,在本文中也称为SEQIDNO:327。术语“PD-1”还包括具有氨基酸序列SEQIDNO:321、322、323或324的PD-1蛋白质变体。术语“PD-1”包括重组PD-1或其片段。该术语还涵盖与例如组氨酸标记、小鼠或人Fc或信号序列如ROR1偶联的PD-1或其片段。例如,该术语包括SEQIDNO:323或324所示例的序列,其在C端包含小鼠Fc(mIgG2a)或人Fc(hIgG1),与具有C93S改变的全长PD-1的氨基酸残基25-170偶联。SEQIDNO:321所示例的蛋白质变体在C端包含组氨酸标记,与全长PD-1的氨基酸残基25-170偶联。除非指定为来自非人物种,术语“PD-1”指人PD-1。PD-1是CD28\/CTLA-4\/ICOS家族T细胞共抑制物的成员。PD-1是288个氨基酸的蛋白质,具有IgV样胞外N端结构域、跨膜结构域及含有基于免疫受体酪氨酸的抑制(ITIM)基序和基于免疫受体酪氨酸的转换(ITSM)基序的胞内结构域(Chattopadhyay等2009,Immunol.Rev.)。PD-1受体具有两个配体,PD-配体-1(PD-L1)和PD-L2。术语“PD-L1”指PD-1受体的也称为CD274和B7H1的配体。全长PD-L1的氨基酸序列在GenBank中以检索号NP_054862.1提供,在本文中也称为SEQIDNO:328。该术语还涵盖与例如组氨酸标记、小鼠或人Fc或信号序列如ROR1偶联的PD-L1或其片段。例如,该术语包括SEQIDNO:325或326所示例的序列,其在C端包含小鼠Fc(mIgG2a)或人Fc(hIgG1),与全长PD-L1的氨基酸残基19-239偶联。PD-L1是290个氨基酸的蛋白质,具有胞外IgV样结构域、跨膜结构域和高度保守的约30个氨基酸的胞内结构域。PD-L1组成性表达在许多细胞如抗原呈递细胞(例如树突细胞、巨噬细胞和B细胞)上和造血及非造血细胞(例如血管内皮细胞、胰岛和特免位点)上。PD-L1还表达在多种肿瘤、病毒感染细胞和自身免疫组织上,且是免疫抑制环境的成分(Ribas2012,NEJM366:2517-2519)。本文所用的术语“T细胞共抑制物”指通过T细胞活化或抑制来调节免疫反应的配体和\/或受体。术语“T细胞共抑制物”(也称为T细胞共信号发放分子)包括但不限于淋巴细胞活化基因3蛋白质(LAG-3,也称为CD223)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、CD-28、2B4、LY108、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白3(TIM3)、具有免疫球蛋白和ITIM的T细胞免疫受体(TIGIT;也称为VSIG9)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1;也称为CD305)、诱导型T细胞共刺激物(ICOS;也称为CD278)、T细胞活化的V-结构域Ig抑制因子(VISTA)和CD160。本文所用的术语“Fc受体”指见于包括B淋巴细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞上的表面受体蛋白质,其对抗体的F区具有结合特异性。术语“Fc受体”包括但不限于Fcγ受体[例如FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)]、Fcα受体(例如FcαRI或CD89)和Fcε受体[例如FcεRI和FcεRII(CD23)]。本文所用的术语“抗体”旨在指包含四条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子(即“全抗体分子”),以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(包含结构域CH1、CH2和CH3)。每条轻链包含轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区,其中嵌入称为构架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR,从氨基端至羧基端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的某些实施方案中,抗体(或其抗原结合片段)的FR可以与人种系序列相同,或者可以是天然修饰或人工修饰的。可以根据两个或多个CDR的并排比较来定义氨基酸共有序列。也可能取代一个或多个CDR残基或删去一个或多个CDR残基。科学文献中已描述了对结合而言可省去其中一个或两个CDR的抗体。Padlan等(1995FASEBJ.9:133-139)根据公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区,并得出结论,只有约五分之一至三分之一的CDR残基实际上接触抗原。Padlan还发现其中一个或两个CDR没有氨基酸与抗原接触的许多抗体(还参见Vajdos等2002JMolBiol320:415-428)。可以根据之前的研究(例如CDRH2中的残基H60-H65常不需要)、从处于ChothiaCDR之外的KabatCDR区域、通过分子模拟和\/或凭经验鉴定不接触抗原的CDR残基。如果删去CDR或其一个或多个残基,通常用在另一人抗体序列或这种序列的共有序列中占据相应位置的氨基酸取代。也可以凭经验选择CDR内的取代位置和取代的氨基酸。经验取代可以是保守或非保守取代。与相应的种系序列相比,本文公开的全人抗PD-1单克隆抗体可以在重链和轻链可变结构域的构架和\/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和\/或缺失。这类突变可以通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列相比较来容易地确定。本发明包括衍生自本文公开的任意氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段,其中将一个或多个构架和\/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为该抗体所衍生自的抗体的种系序列的一个或多个相应的残基,或突变为另一人种系序列的一个或多个相应的残基,或突变为一个或多个相应的种系残基的保守氨基酸取代(这类序列改变在本文中统称为“种系突变”)。从本文公开的重链和轻链可变区序列开始,本领域普通技术人员可以容易地产生许多包含一个或多个单种系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中,将VH和\/或VL结构域内的所有构架和\/或CDR残基回复突变为见于该抗体所衍生自的原种系序列中的残基。在其他实施方案中,仅将某些残基回复突变为原种系序列,例如,仅见于FR1的前8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内的突变残基,或仅见于CDR1、CDR2或CDR3内的突变残基。在其他实施方案中,将一个或多个构架和\/或CDR残基突变为不同种系序列(即不同于该抗体最初所衍生自的种系序列的种系序列)的一个或多个相应的残基。此外,本发明的抗体可以包含构架和\/或CDR区内的两个或多个种系突变的任意组合,例如,其中某些单残基突变为特定种系序列的相应残基,而不同于原种系序列的某些其他残基得以维持或突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得,即可针对一种或多种希望得到的特性容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段,如改善的结合特异性、提高的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物特性(根据情况)、降低的免疫原性等。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明之内。本发明还包括含有本文公开的任意HCVR、LCVR和\/或CDR氨基酸序列的变体的全人抗PD-1单克隆抗体,该变体具有一个或多个保守取代。例如,本发明包括具有HCVR、LCVR和\/或CDR氨基酸序列的抗PD-1抗体,相对于本文公开的任意HCVR、LCVR和\/或CDR氨基酸序列,该HCVR、LCVR和\/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代。本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。例如在CDR尤其是CDR3中,本发明的人mAb可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是,本文所用的术语“人抗体”并非旨在包括其中已将衍生自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列移植到人FR序列上的mAb。该术语包括在非人哺乳动物中或在非人哺乳动物的细胞中重组产生的抗体。该术语并非旨在包括从人个体分离或在人个体中产生的抗体。本文所用的术语“重组”指通过本领域称为重组DNA技术(包括例如DNA剪接和转基因表达)的技术或方法产生、表达、分离或获得的本发明的抗体或其抗原结合片段。该术语指在非人哺乳动物(包括转基因非人哺乳动物,例如转基因小鼠)或细胞(例如CHO细胞)表达系统中表达或从重组组合人抗体文库分离的抗体。本文所用的术语“多特异性抗原结合分子”指双特异性、三特异性或多特异性抗原结合分子,及其抗原结合片段。多特异性抗原结合分子可以对一种靶多肽的不同表位特异,或可以包含对一种以上靶多肽的表位特异的抗原结合结构域。多特异性抗原结合分子可以是简单的多功能多肽,或者它可以是相互共价或非共价结合的两种或多种多肽的多聚体复合物。术语“多特异性抗原结合分子”包括可以与另一功能性分子例如另一种肽或蛋白质连接或共表达的本发明的抗体。例如,可以将抗体或其片段与一种或多种其他分子实体如蛋白质或其片段功能性连接(例如,通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式),以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗原结合分子。根据本发明,术语“多特异性抗原结合分子”还包括双特异性、三特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中,将本发明的抗体与另一抗体或其抗原结合片段功能性连接,以产生具有第二结合特异性的双特异性抗体。本发明的双特异性和多特异性抗体在本文中其他地方描述。术语“特异性结合”或“与…特异性结合”等指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可以表征为至少约1x10-8M或更小的平衡解离常数(例如,KD越小表示结合越紧密)。用于测定两种分子是否特异性结合的方法为本领域公知,且包括例如平衡透析、表面等离振子共振等。如本文所述,通过表面等离振子共振例如BIACORETM鉴定特异性结合PD-1的抗体。此外,但是,结合PD-1中的一个结构域和一种或多种其他抗原的多特异性抗体或结合PD-1的两个不同区域的双特异性抗体视为本文所用的“特异性结合”的抗体。术语“高亲和力”抗体指这样的mAb,通过表面等离振子共振例如BIACORETM或溶液亲和力ELISA测量,该mAb对PD-1具有表示为KD的至少10-7M、优选10-8M、更优选10-9M、甚至更优选10-10M、甚至更优选10-11M的结合亲和力。术语“慢解离速率”、“Koff”或“kd”指通过表面等离振子共振例如BIACORETM测定,以1x10-3s-1或更小、优选1x10-4s-1或更小的速率常数从PD-1解离的抗体。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原形成复合物的任何天然存在、可酶促获得、合成或遗传改造的多肽或糖蛋白。本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”指抗体的保留结合PD-1能力的一个或多个片段。在具体实施方案中,本发明的抗体或抗体片段可以与诸如配体或治疗性部分的部分缀合(“免疫缀合物”),如抗生素,第二抗PD-1抗体,或抗另一抗原(如肿瘤特异性抗原、自身免疫组织抗原、病毒感染细胞抗原、Fc受体、T细胞受体或T细胞共抑制物)的抗体,或免疫毒素,或用于治疗包括癌症、自身免疫病或慢性病毒感染的疾病或病症的任意其他治疗性部分。本文所用的“分离的抗体”旨在指基本不含其他具有不同抗原特异性的抗体(Ab)的抗体(例如,分离的特异性结合PD-1的抗体或其片段基本不含特异性结合PD-1以外的抗原的Ab)。本文所用的“阻断抗体”或“中和抗体”(或“中和PD-1活性的抗体”或“拮抗抗体”)旨在指其与PD-1的结合导致PD-1的至少一种生物活性的抑制的抗体。例如,本发明的抗体可以阻止或阻断PD-1与PD-L1结合。本文所用的“激活抗体”或“增强抗体”(或“激动抗体”)旨在指其与PD-1的结合导致PD-1的至少一种生物活性的提高或刺激的抗体。例如,本发明的抗体可以增加PD-1与PD-L1的结合。本文所用的术语“表面等离振子共振”指允许通过例如用BIACORETM系统(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N.J.)检测生物传感器基质内蛋白质浓度的改变来分析实时生物分子相互作用的光学现象。本文所用的术语“KD”旨在指具体抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。术语“表位”指与抗体分子的可变区中称为互补位的特异性抗原结合部位相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有一个以上表位。因此,不同抗体可以结合抗原上的不同区域,并可以具有不同的生物学效应。术语“表位”还指B和\/或T细胞对其响应的抗原上的部位。它还指抗体所结合的抗原区域。表位可以定义为结构表位或功能表位。功能表位通常是结构表位的亚型,具有对相互作用亲和力有直接贡献的那些残基。表位也可以是构象表位,即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中,表位可以包括决定簇,其是分子的化学活性表面分组,如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基,且在某些实施方案中可以具有特异性三维结构特征,和\/或特异性电荷特征。在提到核酸或其片段时,术语“基本同一性”或“基本同一的”指在带着适当的核苷酸插入或缺失与另一核酸(或其互补链)最佳比对时,如通过任意公知的序列同一性算法(如下文讨论的FASTA、BLAST或GAP)所测量,在至少约90%和更优选至少约95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。在某些情况下,与参考核酸分子具有基本同一性的核酸分子可以编码与参考核酸分子所编码的多肽具有相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。在应用于多肽时,术语“基本相似性”或“基本相似的”是指,在如用默认缺口权重通过程序GAP或BESTFIT最佳比对时,两个肽序列具有至少90%序列同一性、甚至更优选至少95%、98%或99%序列同一性。优选地,不同一的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是这样的取代,其中用具有相似化学性质(例如,电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代氨基酸残基。通常,保守氨基酸取代将不实质性改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列因保守取代而相互不同的情况下,可以上调相似性程度或百分比,以校正该取代的保守性质。进行此调整的手段为本领域技术人员公知。参见例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331,其在此引入作为参考。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括:1)脂肪族侧链:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;2)脂肪族-羟基侧链:丝氨酸和苏氨酸;3)含酰胺侧链:天冬酰胺和谷氨酰胺;4)芳香族侧链:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;5)碱性侧链:赖氨酸、精氨酸和组氨酸;6)酸性侧链:天冬氨酸和谷氨酸;及7)含硫侧链:半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地,保守取代是在Gonnet等(1992)Science256:144345中公开的PAM250log可能性矩阵中具有正值的任意改变,其在此引入作为参考。“中度保守”取代是在PAM250log可能性矩阵中具有非负值的任意改变。多肽的序列相似性通常用序列分析软件测量。蛋白质分析软件用分配给多种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性测量匹配相似的序列。例如,GCG软件包含诸如GAP和BESTFIT的程序,其可以默认参数用来测定密切相关的多肽(如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质和其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG版本6.1。还可以默认或推荐的参数用FASTA比较多肽序列;FASTA是GCG版本6.1中的程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和检索序列间具有最佳重叠的区域的比对和百分比同一性(Pearson(2000)上文)。在将本发明的序列与包含大量来自不同生物的序列的数据库相比较时,另一优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST,尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402,每篇文献在此引入作为参考。短语“治疗有效量”指产生施用它所希望得到的效应的量。确切的量将取决于治疗的目的,且将可由本领域技术人员用已知的技术确定(参见例如Lloyd(1999)TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding)。本文所用的术语“个体”指需要改善、预防和\/或治疗诸如慢性病毒感染、癌症或自身免疫病的疾病或障碍的动物,优选哺乳动物。本文所用的“抗癌药”指用于治疗癌症的任意治疗剂,包括但不限于细胞毒素和治疗剂,如抗代谢物、烷化剂、蒽环类、抗生素、抗有丝分裂剂、甲基苄肼、羟基脲、天冬酰胺酶、糖皮质激素、米托坦(mytotane)(O,P′-(DDD))、biologics(例如抗体和干扰素)放射性治疗剂。本文所用的“细胞毒素或细胞毒剂”还指化疗剂,且指对细胞有害的任意治疗剂。实例包括(紫杉醇(paclitaxel))、替莫唑胺(temozolamide)、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、顺式铂氨、丝裂霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、鬼臼噻吩苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、coichicin、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、普卡霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因(lidocaine)、心得安(propranolol)和嘌呤霉素,及其类似物或同源物。本文所用的术语“抗病毒药”指用于治疗、阻止或改善宿主个体中的病毒感染的任意药物或治疗。术语“抗病毒药”包括但不限于齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、利巴韦林(ribavirin)、洛匹那韦(lopinavir)、依法韦仑(efavirenz)、cobicistat、替诺福韦(tenofovir)、利匹韦林(rilpivirine)、镇痛剂和糖皮质激素。在本发明的背景中,病毒感染包括由病毒引起的长期或慢性感染,该病毒包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。本发明的抗体和抗原结合片段特异性结合PD-1,并调节PD-1与PD-L1的相互作用。抗PD-1抗体可以以高亲和力或以低亲和力结合PD-1。在某些实施方案中,本发明的抗体可以是阻断抗体,其中抗体可以结合PD-1,并阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中,本发明的阻断抗体可以阻断PD-1与PD-L1的结合和\/或刺激或增强T细胞活化。在一些实施方案中,该阻断抗体可以用于刺激或增强免疫反应和\/或用于治疗患有癌症或慢性病毒感染的个体。在对有需要的个体施用时,该抗体可以减少个体中诸如HIV、LCMV或HBV的病毒的慢性感染。它们可以用于抑制个体中的肿瘤细胞生长。它们可以单独或作为本领域已知的其他治疗部分或方式的辅助治疗用于治疗癌症或病毒感染。在其他实施方案中,本发明的抗体可以是激活抗体,其中该抗体可以结合PD-1,并增强PD-1和PD-L1的相互作用。在一些实施方案中,该激活抗体可以增强PD-1与PD-L1的结合和\/或抑制或阻抑T细胞活化。本发明的激活抗体可以用于抑制个体中的免疫反应和\/或用于治疗自身免疫病。在某些实施方案中,该抗PD-1抗体可以是多特异性抗原结合分子,其中它们包含对PD-1的第一结合特异性,及对选自另一T细胞共抑制物、自身免疫组织抗原、T细胞受体、Fc受体、T细胞受体、PD-L1和PD-1的不同表位的抗原的第二结合特异性。在某些实施方案中,本发明的抗体获自小鼠,该小鼠用第一免疫原如全长PD-1[参见GenBank检索号NP_005009.2(SEQIDNO:327)]或用重组形式的PD-1或修饰的人PD-1片段(SEQIDNO:321、323或324)或用修饰的猕猴PD-1片段(SEQIDNO:322)免疫,然后用第二免疫原或用PD-1的免疫原活性片段免疫。免疫原可以是PD-1的生物活性和\/或免疫原性片段或编码其活性片段的DNA。片段可以源自PD-1的N端或C端结构域。在本发明的某些实施方案中,免疫原是PD-1的片段,其是具有C93S改变的SEQIDNO:327的氨基酸残基25-170。肽可以修饰为包括用于标记或与载体分子如KLH缀合的目的的某些残基的添加或取代。例如,可以在肽的N端或C端添加半胱氨酸,或可以添加接头序列,以制备肽用于与例如KLH缀合用于免疫。全长人PD-1的全长氨基酸序列显示为SEQIDNO:327。在某些实施方案中,可以用上述区域的片段或从本文所述区域的N端或C端中的任一端或两端伸出所指定的区域约5个至约20个氨基酸残基的肽制备特异性结合PD-1的抗体。在某些实施方案中,上述区域或其片段的任意组合都可以用于制备PD-1特异性抗体。在某些实施方案中,PD-1的上述区域中的任意一个或多个或其片段都可以用于制备单特异性、双特异性或多特异性抗体。如通过体外或体内测定来测定,本发明的某些抗PD-1抗体能够结合并中和PD-1活性。本发明的抗体结合并中和PD-1活性的能力可以用本领域技术人员已知的标准方法测量,包括本文所述的结合测定或活性测定。用于测量结合活性的非限制性、示例性体外测定在本文实施例中阐述。在实施例3中,通过表面等离振子共振测定人抗PD-1抗体对人PD-1和猕猴PD-1的结合亲和力和动力学常数,在Biacore4000或T200仪器上进行测量。在实施例4和5中,用阻断测定来测定抗PD-1抗体在体外阻断PD-1的PD-L1结合能力的能力。在实施例6中,用阻断测定来测定抗PD-1抗体之间的交叉竞争。实施例7描述抗体与过量表达PD-1的细胞的结合。在实施例8中,用萤光素酶测定来测定抗PD-1抗体拮抗T细胞中的PD-1\/PD-L1信号发放的能力。在某些实施方案中,本发明的抗体能够在体外和在患有癌症的个体中或在病毒如LCMV感染的个体中增强或刺激T细胞活化。在某些实施方案中,本发明的抗体与第二治疗剂如抗第二T细胞共抑制物的抗体组合使用,以在个体中增强免疫应答和抑制肿瘤生长。对PD-1特异的抗体可以不包含附加的标记或部分,或者它们可以包含N端或C端标记或部分。在一个实施方案中,该标记或部分是生物素。在结合测定中,标记(如果存在)的位置可以确定肽相对于该肽所结合的表面的取向。例如,如果用抗生物素蛋白包被表面,则含有N端生物素的肽将这样取向,使得该肽的C端部分将远离该表面。在一个实施方案中,该标记可以是放射性核素、荧光染料或MRI检测标记。在某些实施方案中,这类标记抗体可以用于诊断测定,包括成像测定。抗体的抗原结合片段除非另有明确说明,本文所用的术语“抗体”应理解为涵盖包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体分子(即“全抗体分子”),以及其抗原结合片段。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原形成复合体的任意天然存在、酶促获得、合成或遗传改造的多肽或糖蛋白。本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”指抗体的保留特异性结合PD-1的能力的一个或多个片段。抗体片段可以包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR的片段或分离的CDR。在某些实施方案中,术语“抗原结合片段”指多特异性抗原结合分子的多肽片段。在这类实施方案中,术语“抗原结合片段”包括例如特异性结合PD-1的PD-L1胞外域。抗体的抗原结合片段可以例如用任意适宜的标准技术衍生自全长抗体,如蛋白水解消化或涉及操作和表达编码抗体可变结构域和(可选的)恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。这种DNA已知和\/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体抗体文库)获得,或可以合成。DNA可以进行测序和化学操作或通过使用分子生物学技术来例如将一个或多个可变和\/或恒定结构域排列为适宜的构型,或引入密码子,产生半胱氨酸残基,修饰、添加或缺失氨基酸等。抗原结合片段的非限制性实例包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab')2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)单链Fv(scFv)分子;(vi)dAb片段;及(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如分离的互补决定区(CDR),如CDR3肽)或受限制的FR3-CDR3-FR4肽。其他改造分子也为本文所用的表述“抗原结合片段”所涵盖,如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体(minibody)、纳米抗体(nanobody)(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任意大小或氨基酸组成,且通常将包含至少一个CDR,该CDR邻近一个或多个构架序列或与一个或多个构架序列符合读框。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中,VH和VL结构域可以相对于彼此以任意适宜的排列定位。例如,可变区可以是二聚体,且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。备选地,抗体的抗原结合片段可以包含单体VH或VL结构域。在某些实施方案中,抗体的抗原结合片段可以包含与至少一个恒定区共价连接的至少一个可变结构域。可见于本发明抗体的抗原结合片段内的可变和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括:(i)VH-CH1;(ii)VH-CH2;(iii)VH-CH3;(iv)VH-CH1-CH2;(v)VH-CH1-CH2-CH3;(vi)VH-CH2-CH3;(vii)VH-CL;(viii)VL-CH1;(ix)VL-CH2;(x)VL-CH3;(xi)VL-CH1-CH2;(xii)VL-CH1-CH2-CH3;(xiii)VL-CH2-CH3;及(xiv)VL-CL。在任意可变和恒定结构域构型(包括上文所列的任意示例性构型)中,可变和恒定结构域可以直接相互连接,或者可以通过全长或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成,其在单个多肽分子的邻近可变和\/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性连接。此外,本发明抗体的抗原结合片段可以包含相互和\/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价结合(例如通过一个或多个二硫键)的上文所列任意可变和恒定结构域构型的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。对于全抗体分子,抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域,其中一个可变结构域能够特异性结合分开的抗原或结合同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体型式(包括本文公开的示例性双特异性抗体型式)都可以用本领域可得的常规技术改变以适用于本发明抗体的抗原结合片段的背景。人抗体的制备用于在转基因小鼠中产生人抗体的方法为本领域已知。任何这类已知的方法都可以用于本发明的背景来制备特异性结合PD-1的人抗体。可以用包含以下任一种的免疫原来产生抗PD-1的抗体。在某些实施方案中,本发明的抗体获自用全长天然PD-1(参见GenBank检索号NP_005009.2)(SEQIDNO:327)或用重组PD-1肽免疫的小鼠。备选地,PD-1或其片段可以用标准生物化学技术产生,修饰(SEQIDNO:321-324),并用作免疫原。在某些实施方案中,免疫原可以是来自PD-1的N端或C端的肽。在一个实施方案中,免疫原是PD-1的胞外域或IgV样结构域。在本发明的某些实施方案中,免疫原是PD-1的片段,其是具有C93S改变的SEQIDNO:327的约氨基酸残基25-170。在一些实施方案中,免疫原可以是在大肠杆菌(E.coli)中或在任意其他真核或哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的重组PD-1肽。在某些实施方案中,可以用上述区域的片段或从本文所述区域的N端或C端中的任一端或两端伸出所指定的区域约5个至约20个氨基酸残基的肽制备特异性结合PD-1的抗体。在某些实施方案中,可以用上述区域或其片段的任意组合制备PD-1特异性抗体。使用用于产生单克隆抗体的技术(参见例如US6,596,541,RegeneronPharmaceuticals,)或任意其他已知的方法,最初分离出具有人可变区和小鼠恒定区的抗PD-1的高亲和力嵌合抗体。技术涉及产生转基因小鼠,该转基因小鼠具有包含与内源小鼠恒定区基因座有效连接的人重链和轻链可变区的基因组,使得小鼠响应抗原刺激而产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。分离编码抗体重链和轻链的可变区的DNA,并有效连接至编码人重链和轻链恒定区的DNA。然后在能够表达全人抗体的细胞中表达DNA。生物等效物本发明的抗PD-1抗体和抗体片段涵盖具有与所述抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列但保留结合PD-1的能力的蛋白质。与亲本序列相比,这类变体抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代,但显示与所述抗体的生物活性基本等效的生物活性。同样,本发明的抗体编码DNA序列涵盖这样的序列,与所公开的序列相比,该序列包含一个或多个核苷酸添加、缺失或取代,但编码与本发明的抗体或抗体片段基本生物等效的抗体或抗体片段。如果两种抗原结合蛋白质或抗体例如是在以单个剂量或多个剂量在相似的实验条件下按相同的摩尔剂量施用时吸收的速率和程度未显示显著差异的药物等效物或药物替代物,则认为它们生物等效。如果一些抗体在其吸收的程度而不是其吸收的速率上等效,则将认为它们是等效物或药物替代物,还可以视为生物等效,因为吸收速率的这种差异是有意为之,并反映在标签中,对在例如长期使用时达到有效体内药物浓度并不重要,且对所研究的具体药物产品而言认为在医学上并不显著。在一个实施方案中,如果两种抗原结合蛋白质在其安全性、纯度或效力上不存在具有临床意义的差异,则它们生物等效。在一个实施方案中,与持续治疗而不进行这种转换相比,如果患者可以在参考产品和生物制品之间转换一次或多次而无副作用风险的预期提高(包括临床上显著的免疫原性改变或有效性降低),则认为两种抗原结合蛋白质生物等效。在一个实施方案中,在这种作用机制已知的程度上,对于一种或多种使用条件,如果两种抗原结合蛋白质都通过一种或多种共同的作用机制发挥作用,则它们生物等效。生物等效性可以通过体内和\/或体外方法证明。生物等效性测量包括,例如:(a)人类或其他哺乳动物中的体内测试,其中作为时间的函数测量血液、血浆、血清或其他生物流体中抗体或其代谢物的浓度;(b)与人体内生物利用率数据相关且合理预测人体内生物利用率数据的体外测试;(c)人类或其他哺乳动物中的体内测试,其中作为时间的函数测量抗体(或其靶标)的适当的急性药理效应;和(d)在良好控制的临床试验中建立抗体的安全性、有效性、或生物利用率或生物等效性。通过例如进行生物活性不需要的残基或序列的多种取代或缺失生物活性不需要的末端或内部残基或序列,可以构建本发明的抗体的生物等效变体。例如,对生物活性不重要的半胱氨酸残基可以缺失或用其他氨基酸取代,以阻止在复性时形成不必要或不正确的分子内二硫键。在其他背景中,生物等效抗体可以包括含有氨基酸改变的抗体变体,该氨基酸改变修饰抗体的糖基化特征,例如消除或去除糖基化的突变。包含Fc变体的抗PD-1抗体根据本发明的某些实施方案,提供包含含有一个或多个突变的Fc结构域的抗PD-1抗体,该突变增强或减弱抗体例如与中性pH相比在酸性pH下与FcRn受体的结合。例如,本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中含有突变的抗PD-1抗体,其中该一个或多个突变提高Fc结构域在酸性环境(例如在pH在约5.5至约6.0范围内的内体中)中与FcRn的亲和力。这种突变可以导致对动物施用时抗体血清半衰期的提高。这类Fc修饰的非限制性实例包括,例如:250位(例如E或Q)、250位和428位(例如L或F)、252位(例如L\/Y\/F\/W或T)、254位(例如S或T)和256位(例如S\/R\/Q\/E\/D或T)的修饰;或428位和\/或433位(例如H\/L\/R\/S\/P\/Q或K)和\/或434位(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])的修饰;或250位和\/或428位的修饰;或307位或308位(例如308F、V308F)和434位的修饰。在一个实施方案中,该修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰;428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰;433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰;252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰;250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L);及307和\/或308修饰(例如308F或308P)。还在另一实施方案中,该修饰包括265A(例如D265A)和\/或297A(例如N297A)修饰。例如,本发明包括含有Fc结构域的抗PD-1抗体,该Fc结构域包含选自以下的一对(组)或多对(组)突变:250Q和248L(例如T250Q和M248L);252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E);428L和434S(例如M428L和N434S);257I和311I(例如P257I和Q311I);257I和434H(例如P257I和N434H);376V和434H(例如D376V和N434H);307A、380A和434A(例如T307A、E380A和N434A);和433K和434F(例如H433K和N434F)。在一个实施方案中,本发明包括含有Fc结构域的抗PD-1抗体,该Fc结构域包含IgG4铰链区中的S108P突变以促进二聚体稳定化。前述Fc结构域突变和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变的任意可能的组合都包含在本发明的范围之内。本发明还包括含有嵌合重链恒定(CH)区的抗PD-1抗体,其中该嵌合CH区包含源自一种以上免疫球蛋白同种型的CH区的区段。例如,本发明的抗体可以包含嵌合CH区,该嵌合CH区含有源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部CH2结构域,该CH2结构域与源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部CH3结构域组合。根据某些实施方案,本发明的抗体包含具有嵌合铰链区的嵌合CH区。例如,嵌合铰链可以包含源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(按照EU编号,从216至227位的氨基酸残基),其与源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列(按照EU编号,从228至236位的氨基酸残基)组合。根据某些实施方案,该嵌合铰链区包含源自人IgG1或人IgG4上铰链的氨基酸残基和源自人IgG2下铰链的氨基酸残基。在某些实施方案中,包含本文所述嵌合CH区的抗体显示改变的Fc效应子功能,而对抗体的治疗特性或药代动力学特性无不良影响。(参见2014年1月31日提交的USSN.14\/170,166,其公开内容在此以其整体引入作为参考)。抗体的生物学特征通常,本发明的抗体通过与PD-1结合来发挥作用。本发明包括以高亲和力结合可溶性单体或二聚体PD-1分子的抗PD-1抗体及其抗原结合片段。例如,本发明包括抗体和抗体的抗原结合片段,如例如用本文实施例3中所定义的测定型式通过表面等离振子共振所测量,其以小于约50nM的KD结合单体PD-1(例如,在25℃或在37℃)。在某些实施方案中,如例如用本文实施例3中所定义的测定型式通过表面等离振子共振或基本相似的测定所测量,该抗体或其抗原结合片段以小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约2nM或小于约1nM的KD结合单体PD-1。本发明还包括抗体及其抗原结合片段,如例如用本文实施例3中所定义的测定型式通过表面等离振子共振所测量,其以小于约400pM的KD结合二聚体PD-1(例如,在25℃或在37℃)。在某些实施方案中,如例如用本文实施例3中所定义的测定型式通过表面等离振子共振或基本相似的测定所测量,该抗体或其抗原结合片段以小于约300pM、小于约250pM、小于约200pM、小于约100pM或小于约50pM的KD结合二聚体PD-1。本发明还包括抗体或其抗原结合片段,如例如用本文实施例3中所定义的测定型式通过表面等离振子共振所测量,其以小于约35nM的KD结合猕猴(Macacafascicularis)PD-1(例如,在25℃或在37℃)。在某些实施方案中,如例如用本文实施例3中所定义的测定型式通过表面等离振子共振或基本相似的测定所测量,该抗体或其抗原结合片段以小于约30nM、小于约20nM、小于约15nM、小于约10nM或小于约5nM的KD结合猕猴PD-1。本发明还包括抗体及其抗原结合片段,如例如用本文实施例3中所定义的测定型式在25℃或37℃通过表面等离振子共振或基本相似的测定所测量,其以大于约1.1分钟的解离半衰期(t1\/2)结合PD-1。在某些实施方案中,如例如用本文实施例3中所定义的测定型式(例如,mAb捕获或抗原捕获型式)在25℃或37℃通过表面等离振子共振或基本相似的测定所测量,本发明的抗体或抗原结合片段以大于约5分钟、大于约10分钟、大于约30分钟、大于约50分钟、大于约60分钟、大于约70分钟、大于约80分钟、大于约90分钟、大于约100分钟、大于约200分钟、大于约300分钟、大于约400分钟、大于约500分钟、大于约600分钟、大于约700分钟、大于约800分钟、大于约900分钟、大于约1000分钟或大于约1200分钟的t1\/2结合PD-1。本发明还包括抗体或其抗原结合片段,如用例如实施例4中所示的基于ELISA的免疫测定或基本相似的测定所测定,其以小于约3nM的IC50阻断PD-1与PD-L1的结合。本发明还包括结合PD-1并增强PD-1与PD-L1的结合的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中,本发明的抗体可以结合PD-1的胞外域或结合该结构域的片段。在一些实施方案中,本发明的抗体可以结合一个以上结构域(交叉反应性抗体)。在某些实施方案中,本发明的抗体可以结合定位在包含PD-1(SEQIDNO:327)的氨基酸残基21-171的胞外域中的表位。在一个实施方案中,该抗体可以结合包含选自SEQIDNO:321-324的氨基酸残基1-146的一个或多个氨基酸的表位。在某些实施方案中,通过结合全长蛋白质(其氨基酸序列显示在SEQIDNO:327中)的任意其他区域或片段,本发明的抗体可以通过阻断或抑制与PD-1相关的PD-L1结合活性来发挥作用。在某些实施方案中,该抗体可以减弱或调节PD-1和PD-L1之间的相互作用。在某些实施方案中,本发明的抗体可以是双特异性抗体。本发明的双特异性抗体可以结合PD-1的一个结构域中的一个表位,且还可以结合PD-1的不同结构域中的第二表位。在某些实施方案中,本发明的双特异性抗体可以结合同一结构域中的两个不同表位。在一个实施方案中,该多特异性抗原结合分子包含第一结合特异性,其中该第一结合特异性包含PD-L1的胞外域或其片段;及针对另一PD-1表位的第二结合特异性。在一个实施方案中,本发明提供分离的结合PD-1的全人单克隆抗体或其抗原结合片段,其中该抗体或其片段显示一种或多种以下特征:(i)包含HCVR,该HCVR具有选自SEQIDNO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282、290、298、306和314的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;(ii)包含LCVR,该LCVR具有选自SEQIDNO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186和202的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;(iii)包含HCDR3结构域,该HCDR3结构域具有选自SEQIDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312和320的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;及LCDR3结构域,该LCDR3结构域具有选自SEQIDNO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192和208的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;(iv)包含HCDR1结构域,该HCDR1结构域具有选自SEQIDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308和316的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;HCDR2结构域,该HCDR2结构域具有选自SEQIDNO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、222、230、238、246、254、262、270、278、286、294、302、310和318的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;LCDR1结构域,该LCDR1结构域具有选自SEQIDNO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188和204的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;及LCDR2结构域,该LCDR2结构域具有选自SEQIDNO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190和206的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;(v)是多特异性抗原结合分子,该多特异性抗原结合分子包含针对PD-1的第一结合特异性,及针对选自PD-1、肿瘤特异性抗原、自身免疫组织特异性抗原、病毒感染细胞抗原、不同T细胞共抑制物、T细胞受体和Fc受体的抗原的第二结合特异性;(vi)以约28pM至约1.5μM的KD结合人PD-1;(vii)以约3nM至约7.5μM的KD结合猕猴PD-1;(viii)以≤约3.3nM的IC50阻断或增强PD-1与PD-L1的结合;(ix)阻断PD-1诱导的T细胞下调和\/或在T细胞\/APC萤光素酶报告基因测定中挽救T细胞信号发放;(x)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中刺激T细胞增殖和活性;(xi)在MLR测定中诱导IL-2和\/或干扰素γ产生;及(xii)在患有癌症的个体中抑制肿瘤生长和增加存活期。在一个实施方案中,本发明提供分离的阻断PD-1与PD-L1的结合的全人单克隆抗体或其抗原结合片段,其中该抗体或其片段显示一种或多种以下特征:(i)包含HCVR,该HCVR具有选自SEQIDNO:130、162、234和314的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;(ii)包含LCVR,该LCVR具有选自SEQIDNO:138、170、186和202的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;(iii)包含HCDR3结构域,该HCDR3结构域具有选自SEQIDNO:136、168、240和320的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;及LCDR3结构域,该LCDR3结构域具有选自SEQIDNO:144、176、192和208的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;(iv)包含HCDR1结构域,该HCDR1结构域具有选自SEQIDNO:132、164、236和316的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;HCDR2结构域,该HCDR2结构域具有选自SEQIDNO:134、166、238和318的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;LCDR1结构域,该LCDR1结构域具有选自SEQIDNO:140、172、188和204的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;及LCDR2结构域,该LCDR2结构域具有选自SEQIDNO:142、174、190和206的氨基酸序列,或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列;(v)是多特异性抗原结合分子,该多特异性抗原结合分子包含针对PD-1的第一结合特异性,及针对选自PD-1的不同表位、肿瘤特异性抗原、自身免疫组织特异性抗原、病毒感染细胞抗原、不同T细胞共抑制物、T细胞受体和Fc受体的抗原的第二结合特异性;(vi)以KD≤10-9M结合人PD-1;(vii)以KD≤0-8M结合猕猴PD-1;(viii)以IC50≤10-10M阻断PD-1与PD-L1的结合;(ix)阻断PD-1诱导的T细胞下调和\/或在T细胞\/APC萤光素酶报告基因测定中挽救T细胞信号发放;(x)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中刺激T细胞增殖和活性;(xi)在MLR测定中诱导IL-2和\/或干扰素γ产生;及(xii)在患有癌症的个体中抑制肿瘤生长和增加存活期。本发明的抗体可以具有一种或多种前述生物学特征或其任意组合。对本领域普通技术人员而言,本发明的抗体的其他生物学特征将从本公开(包括本文的工作实施例)的审阅显而易见。物种选择性和物种交叉反应性根据本发明的某些实施方案,抗PD-1抗体结合人PD-1而不结合来自其他物种的PD-1。备选地,在某些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体结合人PD-1,并结合来自一个或多个非人物种的PD-1。例如,本发明的抗PD-1抗体可以结合人PD-1,且根据情况可以结合或不结合小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、狨猴、猕猴或黑猩猩PD-1。在某些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体可以以相同的亲和力或以不同的亲和力结合人和猕猴PD-1,但不结合大鼠和小鼠PD-1。表位定位及相关技术本发明包括与见于PD-1的一个或多个结构域(包括例如胞外(IgV样)结构域、跨膜结构域及含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)和基于免疫受体酪氨酸的转换基序(ITSM)的胞内结构域)内的一个或多个氨基酸相互作用的抗PD-1抗体。抗体所结合的表位可以由定位在PD-1分子的任意前述结构域内的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)氨基酸的单个连续序列组成(例如结构域中的线性表位)。备选地,表位可以由定位在PD-1分子的前述结构域的任一个或两个内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如构象表位)。本领域普通技术人员已知的多种技术可以用于确定抗体是否与多肽或蛋白质内的一个或多个氨基酸相互作用。示例性技术包括例如常规交叉阻断测定,如Antibodies,Harlow和Lane(ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY)中所述的交叉阻断测定。其他方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)MethodsMol.Biol.248:443-63)、肽切割分析、晶体学研究和NMR分析。此外,可以利用诸如表位切除、表位提取和抗原化学修饰的方法(Tomer(2000)Prot.Sci.9:487-496)。另一种可以用来鉴定多肽内与抗体相互作用的氨基酸的方法是通过质谱分析法检测的氢\/氘交换。一般而言,氢\/氘交换法涉及氘标记目的蛋白质,然后使抗体与到标记的蛋白质结合。然后,将蛋白质\/抗体复合物转移至水,受抗体复合物保护的氨基酸内可交换的质子按比不是界面的部分的氨基酸内可交换的质子慢的速率进行氘至氢的回复交换。因此,形成蛋白质\/抗体界面的部分的氨基酸可以保留氘,因此与不包括在界面中的氨基酸相比显示相对高的质量。解离抗体后,对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析法分析,从而揭示对应于与抗体相互作用的具体氨基酸的氘标记残基。参见例如Ehring(1999)AnalyticalBiochemistry267:252-259;Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。术语“表位”指B和\/或T细胞所响应的抗原上的部位。B细胞表位可以形成自连续氨基酸或通过蛋白质的三级结构折叠而并置在一起的非连续氨基酸二者。形成自连续氨基酸的表位通常在暴露于变性溶剂时得以保留,而形成自三级结构折叠的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包括处于独特空间构象的至少3个且更通常是至少5个或8-10个氨基酸。修饰辅助分析(MAP)也称为基于抗原结构的抗体分析(ASAP),是根据每种抗体与化学修饰或酶促修饰的抗原表面的结合特征的相似性来分类针对同一抗原的大量单克隆抗体(mAb)的方法(参见US2004\/0101920,本文明确以其整体引入作为参考)。每个种类可以反映与另一种类所代表的表位明显不同或部分重叠的独特表位。此技术允许快速过滤遗传上相同的抗体,使得表征可以集中在遗传上不同的抗体。在应用于杂交瘤筛选时,MAP可以便于鉴定产生具有希望得到的特征的mAb的稀有杂交瘤克隆。MAP可以用于将本发明的抗体分选为结合不同表位的抗体。在某些实施方案中,抗PD-1抗体或其抗原结合片段结合SEQIDNO:327中所示例的处于天然形式的或SEQIDNO:321-324中所示例的重组产生的PD-1中所示例的任意一个或多个区域内的表位,或其片段。在一些实施方案中,本发明的抗体结合包含选自PD-1的氨基酸残基21-171的一个或多个氨基酸的胞外区域。在一些实施方案中,本发明的抗体结合包含选自SEQIDNO:322所示例的猕猴PD-1的氨基酸残基1-146的一个或多个氨基酸的胞外区域。在某些实施方案中,表1中所示的本发明的抗体与选自以下的至少一个氨基酸序列相互作用:SEQIDNO:327的约21位至约136位的氨基酸残基;或SEQIDNO:327的约136位至约171位的氨基酸残基。这些区域部分示例在SEQIDNO:321-324中。本发明包括与本文表1中所述的任意具体的示例性抗体或具有表1中所述的任意示例性抗体的CDR序列的抗体结合相同的表位或表位部分的抗PD-1抗体。同样,本发明还包括与本文表1中所述的任意具体的示例性抗体或具有表1中所述的任意示例性抗体的CDR序列的抗体竞争结合PD-1或PD-1片段的抗PD-1抗体。例如,本发明包括与本文实施例6中所定义的一种或多种抗体(例如H2aM7788N、H4xH8992P、H4xH8999P、H1M7799N、H2aM7780N、H1M7800N、H2aM7794N、H2aM7798N、H4xH9145P2、H4H9057P2、H4xH9120P2、H4xH9128P2、H4H9019P、H4xH9119P2、H4xH9135P2、H4xH9034P、H2aM7790N、H4xH9035P、H4xH9037P、H4xH9045P和H2aM7795N)交叉竞争结合PD-1的抗PD-1抗体。通过使用本领域已知的常规技术,可以容易地确定抗体是否与参考抗PD-1抗体结合相同的表位,或与参考抗PD-1抗体竞争结合。例如,为了确定测试抗体是否与本发明的参考抗PD-1抗体结合相同的表位,使参考抗体在饱和条件下结合PD-1蛋白质或肽。然后,评估测试抗体结合PD-1分子的能力。如果测试抗体能够在用参考抗PD-1抗体饱和结合之后结合PD-1,则可以得出结论,测试抗体结合不同于参考抗PD-1抗体的表位。另一方面,如果测试抗体不能在用参考抗PD-1抗体饱和结合之后结合PD-1蛋白质,则测试抗体可以结合与本发明的参考抗PD-1抗体所结合的表位相同的表位。为了确定抗体是否与参考抗PD-1抗体竞争结合,在两个方向上进行上述结合方法:在第一个方向上,使参考抗体在饱和条件下结合PD-1蛋白质,然后评估测试抗体与PD-1分子的结合。在第二个方向上,使测试抗体在饱和条件下结合PD-1分子,然后评估参考抗体与PD-1分子的结合。在两个方向上,如果只有第一(饱和)抗体能够结合PD-1分子,则可以得出结论,测试抗体和参考抗体竞争结合PD-1。如本领域普通技术人员所理解,与参考抗体竞争结合的抗体并非必然与参考抗体结合相同的表位,但可以通过结合重叠表位或邻近表位而在空间上阻断参考抗体的结合。如果每种抗体竞争性抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合,则两种抗体结合相同表位或重叠表位。这就是说,如在竞争结合测定中所测量,1、5、10、20或100倍过量的一种抗体使另一种抗体的结合抑制了至少50%但优选75%、90%或甚至99%(参见例如Junghans等,CancerRes.199050:1495-1502)。备选地,如果抗原中基本上所有减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变减少或消除了另一种抗体的结合,则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除了另一种抗体的结合,则两种抗体具有重叠的表位。然后可以进行附加的常规实验(例如肽突变和结合分析),以确认所观察到的测试抗体的结合的缺乏实际上是否由于结合与参考抗体相同的表位,或空间阻断(或另一种现象)是否造成所观察到的结合的缺乏。此类实验可以用ELISA、RIA、表面等离振子共振、流式细胞术或本领域可得的任意其他定量或定性抗体结合测定进行。免疫缀合物本发明涵盖与治疗性部分(如细胞毒素或化疗剂)缀合来治疗癌症的人抗PD-1单克隆抗体。本文所用的术语“免疫缀合物”指通过化学或生物学方法与细胞毒素、放射性物质、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、毒素、肽或蛋白质或治疗剂连接的抗体。抗体可以沿着分子在任何位置与细胞毒素、放射性物质、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、毒素、肽或治疗剂连接,只要它能够结合其靶标。免疫缀合物的实例包括抗体药物缀合物和抗体-毒素融合蛋白。在一个实施方案中,该物质可以是抗PD-1的第二种不同的抗体。在某些实施方案中,该抗体可以与对肿瘤细胞或病毒感染细胞特异的物质缀合。可以与抗PD-1抗体缀合的治疗性部分的类型将考虑到待治疗的病症及要达到的希望得到的疗效。适合用于形成免疫缀合物的物质的实例为本领域已知;参见例如WO05\/103081。多特异性抗体本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位特异,或可以包含对一种以上靶多肽特异的抗原结合结构域。参见例如Tutt等,1991,J.Immunol.147:60-69;Kufer等,2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。在一方面,本发明包括多特异性抗原结合分子或其抗原结合片段,其中免疫球蛋白的一种特异性对PD-1的胞外域或其片段特异,免疫球蛋白的另一种特异性对结合PD-1的胞外域外侧或第二治疗靶标特异,或与治疗性部分缀合。在某些实施方案中,该第一抗原结合特异性可以包含PD-L1或PD-L2,或其片段。在本发明的某些实施方案中,免疫球蛋白的一种特异性对包含PD-1(SEQIDNO:327)的氨基酸残基21-171或其片段的表位特异,免疫球蛋白的另一种特异性对第二靶抗原特异。该第二靶抗原可以与PD-1在同一细胞上或在不同细胞上。在一个实施方案中,该第二靶细胞在除T细胞外的免疫细胞上,如B细胞、抗原呈递细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方案中,该第二靶抗原可以存在于肿瘤细胞或自身免疫组织细胞上或病毒感染细胞上。在另一方面,本发明提供多特异性抗原结合分子或其抗原结合片段,其包含结合PD-1的第一抗原结合特异性,及结合T细胞受体、B细胞受体或Fc受体的第二抗原结合特异性。在相关方面,本发明提供多特异性抗原结合分子或其抗原结合片段,其包含结合PD-1的第一抗原结合特异性,及结合不同T细胞共抑制物如LAG-3、CTLA-4、BTLA、CD-28、2B4、LY108、TIGIT、TIM3、LAIR1、ICOS和CD160的第二抗原结合特异性。在另一方面,本发明提供多特异性抗原结合分子或其抗原结合片段,其包含结合PD-1的第一抗原结合特异性,及结合自身免疫组织特异性抗原的第二抗原结合特异性。在某些实施方案中,该抗体可以是激活或激动抗体。可以用本领域普通技术人员已知的标准分子生物学技术(例如重组DNA和蛋白质表达技术)构建本发明的任意多特异性抗原结合分子,或其变体。在一些实施方案中,以双特异性型式(“双特异性”)产生PD-1特异性抗体,其中将结合PD-1不同结构域的可变区连接在一起,以在单个结合分子内赋予双结构域特异性。适当设计的双特异性抗体可以通过提高两种特异性和结合亲和力来增强总体PD-1抑制效能。对单个结构域(例如N端结构域的区段)具有特异性或可以结合一个结构域内的不同表位的可变区在允许每个区域同时结合分开的表位或结合一个结构域内的不同表位的结构支架上配对。在双特异性抗体的一个实例中,将来自对一个结构域具有特异性的结合剂的重链可变区(VH)与来自对第二结构域具有特异性的一系列结合剂的轻链可变区(VL)重组,以鉴定可以与原VH配对而不破坏该VH原有的特异性的非关联VL配偶体。以这种方式,可以将单个VL区段(例如VL1)与两个不同的VH结构域(例如VH1和VH2)组合,以产生包含两个结合“臂”(VH1-VL1和VH2-VL1)的双特异性抗体。单个VL区段的使用降低了系统的复杂性,从而简化了用于产生该双特异性抗体的克隆、表达和纯化过程并提高了其效率(参见例如USSN13\/022759和US2010\/0331527)。备选地,可以使用本文所述的技术或本领域技术人员已知的其他技术,以双特异性型式制备结合一个以上结构域和第二靶标的抗体,如但不限于,例如第二种不同的抗PD-1抗体。结合不同区域的抗体可变区可以与结合例如PD-1胞外域上的相关部位的可变区连接在一起,以在单个结合分子内赋予双抗原结合特异性。适当设计的具有这种性质的双特异性抗体发挥双重功能。将对胞外域具有特异性的可变区与对胞外域之外具有特异性的可变区组合,并在允许每个可变区结合分开的抗原的结构支架上配对。可以用于本发明背景中的示例性双特异性抗体型式涉及第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二IgCH3结构域的使用,其中该第一和第二IgCH3结构域因至少一个氨基酸而相互不同,且其中与缺乏该氨基酸差异的双特异性抗体相比,至少一个氨基酸差异减少了该双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中,该第一IgCH3结构域结合蛋白A,该第二IgCH3结构域包含减少或废除蛋白A结合的突变,如H95R修饰(按IMGT外显子编号;按EU编号为H435R)。该第二CH3可以进一步包含Y96F修饰(按IMGT;按EU为Y436F)。可见于该第二CH3内的其他修饰包括:IgG1抗体情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按IMGT;按EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I);IgG2抗体情况下的N44S、K52N和V82I(IMGT;按EU为N384S、K392N和V422I);IgG4抗体情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按IMGT;按EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。本文所述双特异性抗体型式上变异也包含在本发明的范围之内。可用于本发明背景中的其他示例性双特异性型式包括但不限于,例如,基于scFv的双特异性型式或双抗体双特异性型式、IgG-scFv融合、双可变结构域(DVD)-Ig、四价体杂交瘤、杵入臼、共同轻链(例如具有杵入臼的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1\/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性型式(对于前述型式的综述,参见例如Klein等2012,mAbs4:6,1-11,及其中引用的参考文献)。还可以用肽\/核酸缀合来构建双特异性抗体,例如,其中用具有正交化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物,然后其自组装为具有确定组成、效价和几何形状的多聚体复合物(参见例如Kazane等,J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。治疗施用和制剂本发明提供包含本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。本发明的治疗组合物将伴随掺入制剂以提供改善的转移、递送、耐受等的适宜的载体、赋形剂和其他物质施用。许多适当的制剂可见于所有药物化学家公知的处方集Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton,PA中。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、膏剂、胶冻剂、蜡、油、脂质、含脂(阳离子或阴离子)小泡(如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳状液、聚乙二醇(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。参见例如Powell等\Compendiumofexcipientsforparenteralformulations\PDA(1998)JPharmSciTechnol52:238-311。抗体的剂量可以取决于待施用的个体的年龄和体型大小、目标疾病、病症、给药途径等因素而不同。在本发明的抗体用于治疗成年患者中的疾病或障碍或用于预防这种疾病时,通常按约0.1至约60mg\/kg体重、更优选约5至约60、约10至约90或约20至约50mg\/kg体重的单剂量施用本发明的抗体是有利的。取决于病症的严重度,可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段可以作为至少约0.1mg至约800mg、约1至约500mg、约5至约300mg、或约10至约200mg、约100mg、或至约50mg的起始剂量施用。在某些实施方案中,起始剂量之后可以按与起始剂量的量大致相同或比起始剂量的量低的量施用抗体或其抗原结合片段的第二剂量或多个后续剂量,其中后续剂量间隔至少1天至3天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少12周或至少14周。多种递送系统是已知的,并可用于施用本发明的药物组合物,例如包封在脂质体、微粒、微囊中,能够表达突变体病毒的重组细胞,受体介导的胞吞(参见例如Wu等(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限于皮内、经皮、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径施用,例如通过输注或快速浓注,通过表皮或黏膜皮肤衬里(例如,口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收,并可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身施用或局部施用。药物组合物还可以在小泡尤其是脂质体中递送(参见例如Langer(1990)Science249:1527-1533)。本文还考虑纳米颗粒在递送本发明的抗体中的用途。抗体缀合的纳米颗粒可以用于治疗和诊断应用二者。Arruebo,M.等2009(“Antibody-conjugatednanoparticlesforbiomedicalapplications”inJ.Nanomat.2009卷,文章ID439389,24页,doi:10.1155\/2009\/439389)详细描述了抗体缀合的纳米颗粒及制备方法和用途,其在此引入作为参考。可以开发纳米颗粒,并与包含在药物组合物中的抗体缀合,以靶向肿瘤细胞或自身免疫组织细胞或病毒感染细胞。用于药物递送的纳米颗粒还描述于例如US8257740或US8246995中,每个专利在此以其整体引入。在某些情况下,药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方案中,可以使用泵。在另一实施方案中,可以使用聚合材料。还在另一实施方案中,控释系统可以靠近组合物的靶标放置,从而仅需要全身剂量的一部分。可注射制备物可以包括用于静脉内、皮下、皮内、颅内、腹腔内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制备物可以通过公知的方法制备。例如,可以通过在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化上述抗体或其盐来制备可注射制备物。作为用于注射的水性介质,存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等,其可以与适当的加溶剂如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨酸酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质,可利用例如芝麻油、大豆油等,其可以与加溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。这样制备的注射液优选装入适当的安瓿。本发明的药物组合物可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外,对于皮下递送,即用笔递送装置可用于递送本发明的药物组合物。这种笔递送装置可以重复使用或一次性使用。可重复使用的笔递送装置通常利用含有药物组合物的可替换筒。桶内的所有药物组合物已施用而筒变空时,可以容易地废弃空筒,并用含有药物组合物的新筒替换。笔递送装置则可以重复使用。在一次性笔递送装置中,没有可替换的筒。相反,一次性笔递送装置预装了容纳在装置内的容器中的药物组合物。容器清空药物组合物时,废弃整个装置。许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置可用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但当然不限于AUTOPENTM(OwenMumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(DisetronicMedicalSystems,Burghdorf,瑞士)、HUMALOGMIX75\/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN70\/30TM笔(EliLillyandCo.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II和III(NovoNordisk,Copenhagen,丹麦)、NOVOPENJUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,丹麦)、BDTM笔(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPENPROTM、OPTIPENSTARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,德国),仅举几个为例。可用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔递送装置的实例包括但当然不限于SOLOSTARTM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(NovoNordisk)和KWIKPENTM(EliLilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,ThousandOaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,德国)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATMPen(AbbottLabs,AbbottPark,IL),仅举几个为例。有利地,将上述用于口服或胃肠外使用的药物组合物配制为适于固定活性成分剂量的单位剂量的剂型。这类单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。所包含的抗体的量通常为约每个单位剂量的剂型约5至约500mg,尤其是注射剂形式,对于其他剂型,优选以约5至约100mg和以约10至约250mg包含抗体。抗体的治疗用途本发明的抗体尤其用于治疗、预防和\/或改善与PD-1表达、信号发放或活性相关或由PD-1表达、信号发放或活性介导,或可通过阻断PD-1和PD-1配体(例如PD-L1或PD-L2)之间的相互作用或以其他方式抑制PD-1活性和\/或信号发放来治疗的任意疾病或障碍。例如,本发明提供通过对需要这种治疗的患者施用本文所述抗PD-1抗体(或包含抗PD-1抗体的药物组合物)来治疗癌症(肿瘤生长抑制)、慢性病毒感染和\/或自身免疫病的方法。本发明的抗体用于治疗、预防和\/或改善疾病或障碍或病症,如癌症、自身免疫病或病毒感染,和\/或用于改善与这种疾病、障碍或病症相关的至少一种症状。在本文所述治疗方法的背景中,抗PD-1抗体可以作为单一治疗(即作为唯一的治疗剂)或与一种或多种附加治疗剂(其实例在本文中其他地方描述)组合施用。在本发明的一些实施方案中,本文所述抗体用于治疗患有原发性或复发性癌症的个体,其包括但不限于肾细胞癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、脑癌(例如多形性成胶质细胞瘤)、头和颈鳞状细胞癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤和黑素瘤。抗体可以用于治疗癌症的早期或晚期症状。在一个实施方案中,本发明的抗体或其片段可以用于治疗转移性癌症。抗体用于减少或抑制或缩小实体肿瘤和血液癌症二者的肿瘤生长。在某些实施方案中,用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗导致个体中的肿瘤消退超过50%、消退超过60%、消退超过70%、消退超过80%或消退超过90%。在某些实施方案中,抗体可以用于阻止肿瘤的复发。在某些实施方案中,抗体用于在患有癌症的个体中延长总存活期。在一些实施方案中,抗体用于在患有癌症的患者中降低化疗或放疗引起的毒性,同时维持长期存活。在某些实施方案中,本发明的抗体用于治疗患有慢性病毒感染的个体。在一些实施方案中,本发明的抗体用于减少宿主中的病毒滴度和\/或挽救衰竭的T细胞。在某些实施方案中,本发明的抗体或其片段可以用于治疗淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)引起的慢性病毒感染。在一些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段可以按治疗剂量对患有人免疫缺陷病毒(HIV)或人乳头瘤病毒(HPV)或乙型\/丙型肝炎病毒(HBV\/HCV)感染的患者施用。在相关实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段可以用于在猿猴个体如猕猴中治疗猿猴免疫缺陷病(SIV)感染。在某些实施方案中,本发明的阻断抗体可以按治疗有效量对患有癌症或病毒感染的个体施用。在某些实施方案中,本发明的抗体用于治疗自身免疫病,其包括但不限于斑秃、自身免疫性肝炎、乳糜泻、格雷夫斯病、急性特发性多发性神经炎、桥本病、溶血性贫血、炎性肠病、炎性肌病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、白癜风、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性血小板减少性紫癜、克隆病、I型糖尿病、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性肠胃炎、肺出血-肾炎综合征、重症肌无力、银屑病关节炎、风湿热、溃疡性结肠炎、脉管炎和韦格纳肉芽肿病。在某些实施方案中,本发明的激活抗体可以用于治疗患有自身免疫病的个体。可以施用本发明的一种或多种抗体来减轻或阻止或降低疾病或障碍的一种或多种症状或状况的严重度。本文还考对处于发展诸如癌症、自身免疫病和慢性病毒感染的疾病或障碍的风险的患者预防性使用本发明的一种或多种抗体。在本发明的另一实施方案中,该抗体用于制备用于治疗患有癌症、自身免疫病或病毒感染的患者的药物组合物。在本发明的另一实施方案中,该抗体用作本领域技术人员已知用于治疗癌症、自身免疫病或病毒感染的任意其他治疗剂或任意其他治疗的辅助治疗。联合治疗和制剂联合治疗可以包括本发明的抗PD-1抗体及可以有利地与本发明的抗体或与本发明的抗体的生物活性片段组合的任意附加治疗剂。本发明的抗体可以与一种或多种用于治疗癌症(包括例如肾细胞癌、结肠直肠癌、多形性成胶质细胞瘤、头和颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌、腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤和黑素瘤)的抗癌药或治疗协同组合。本文考虑用本发明的抗PD-1抗体与免疫刺激和\/或免疫支持治疗组合来抑制肿瘤生长和\/或增强癌症患者的存活。免疫刺激治疗包括通过在受抑制的免疫细胞上“释放刹车”或“踩油门”来增强免疫细胞活性以激活免疫反应的直接免疫刺激治疗。实例包括靶向其他其他检验点受体、接种和佐剂。免疫支持方式可以通过促进免疫原性细胞死亡、炎症来提高肿瘤的抗原性,或具有促进抗肿瘤免疫反应的其他间接效应。实例包括放疗、化疗、抗血管发生剂和手术。在多种实施方案中,可以将本发明的一种或多种抗体与以下组合使用:抗PD-L1的抗体、抗PD-1的第二抗体(例如nivolumab)、LAG-3抑制剂、CTLA-4抑制剂(例如伊匹单抗)、TIM3抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、另一T细胞共抑制物或配体的拮抗剂(例如,抗CD-28,2B4,LY108,LAIR1,ICOS,CD160或VISTA的抗体)、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂[例如,“VEGF-Trap”如阿柏西普或US7,087,411中所示的其他VEGF抑制融合蛋白,或抗VEGF抗体或其抗原结合片段(例如贝伐单抗或兰尼单抗(ranibizumab)),或VEGR受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))]、Ang2抑制剂(例如nesvacumab)、转化生长因子β(TGFβ)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab))、共刺激受体激动剂(例如糖皮质素诱导的TNFR相关蛋白的激动剂)、抗肿瘤特异性抗原(例如CA9、CA125、黑素瘤相关抗原3(MAGE3)、癌胚抗原(CEA)、波形蛋白、肿瘤-M2-PK、前列腺特异性抗原(PSA)、黏蛋白-1、MART-1和CA19-9)的抗体、疫苗(例如癌症疫苗卡介苗)、增加抗原呈递的佐剂(例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、双特异性抗体(例如CD3xCD20双特异性抗体、PSMAxCD3双特异性抗体)、细胞毒素、化疗剂(例如达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺、环磷酰胺、多西紫杉醇(docetaxel)、多柔比星、柔红霉素、顺式铂氨、脱羧铂氨、吉西他滨(gemcitabine)、氨甲蝶呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇和长春新碱)、环磷酰胺、放疗、IL-6R抑制剂(例如sarilumab)、IL-4R抑制剂(例如dupilumab)、IL-10抑制剂、细胞因子如IL-2、IL-7、IL-21和IL-15、抗体-药物缀合物(ADC)(例如抗CD19-DM4ADC和抗DS6-DM4ADC)、抗炎药(例如糖皮质激素和非类固醇抗炎药)、膳食补充剂如抗氧化剂或治疗癌症的任何姑息治疗。在某些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体可以与癌症疫苗(包括树突细胞疫苗、溶瘤病毒、肿瘤细胞疫苗等)组合使用,以增强抗肿瘤反应。可以与本发明的抗PD-1抗体组合使用的癌症疫苗的实例包括用于黑素瘤和膀胱癌的MAGE3疫苗,用于乳腺癌的MUC1疫苗,用于脑癌(包括多形性成胶质细胞瘤)的EGFRv3(例如Rindopepimut),或ALVAC-CEA(用于CEA+癌症)。在某些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体可以在产生长期持久抗肿瘤反应和\/或增强癌症患者存活的方法中与放疗组合施用。在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体可以对癌症患者施用放疗之前、同时或之后施用。例如,可以以一个或多个剂量对肿瘤病灶施用放疗,然后使用一个或多个剂量的本发明的抗PD-1抗体。在一些实施方案中,可以对肿瘤病灶局部施用放疗,以增强患者肿瘤的局部免疫原性(辅助性放射)和\/或杀死肿瘤细胞(烧蚀性放射),然后全身施用本发明的抗PD-1抗体。例如,可以与本发明的抗PD-1抗体的全身施用组合,对脑癌(例如多形性成胶质细胞瘤)患者施用颅内放射。在某些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体可以与放疗和化疗剂(例如替莫唑胺)或VEGF拮抗剂(例如阿柏西普)组合施用。在某些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体可以与一种或多种抗病毒药组合施用,以治疗由LCMV、HIV、HPV、HBV或HCV引起的慢性病毒感染。抗病毒药的实例包括但不限于齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、利巴韦林、洛匹那韦、依法韦仑、cobicistat、替诺福韦、利匹韦林和糖皮质激素。在一些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体可以与LAG3抑制剂、CTLA-4抑制剂或另一T细胞共抑制物的拮抗剂组合施用,以治疗慢性病毒感染。在某些实施方案中,本发明的抗PD-1抗体可以与抗免疫细胞上的Fc受体的抗体组合施用,用于治疗自身免疫病。在一个实施方案中,本发明的抗体或其片段与靶向自身免疫组织特异的抗原的抗体或抗原结合蛋白质组合施用。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段与靶向T细胞受体或B细胞受体(包括但不限于Fcα(例如CD89)、Fcγ(例如CD64、CD32、CD16a和CD16b)、CD19等)的抗体或抗原结合蛋白质组合施用。本发明的抗体或其片段可以与本领域已知的任意药物或治疗(例如糖皮质激素和其他免疫抑制剂)组合使用,以治疗自身免疫疾病或障碍,该自身免疫疾病或障碍包括但不限于斑秃、自身免疫性肝炎、乳糜泻、格雷夫斯病、急性特发性多发性神经炎、桥本病、溶血性贫血、炎性肠病、炎性肌病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、白癜风、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性血小板减少性紫癜、克隆病、I型糖尿病、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性肠胃炎、肺出血-肾炎综合征、重症肌无力、银屑病关节炎、风湿热、溃疡性结肠炎、脉管炎和韦格纳肉芽肿病。可以在施用本发明的抗PD-1抗体之前、与之同时或之后施用一种或多种附加的治疗活性剂\/成分。为了本公开的目的,认为这类施用方案是与第二治疗活性成分“组合”施用抗PD-1抗体。可以在施用本发明的抗PD-1抗体之前对个体施用一种或多种附加的治疗活性成分。例如,如果第一成分在施用第二成分之前1周、之前72小时、之前60小时、之前48小时、之前36小时、之前24小时、之前12小时、之前6小时、之前5小时、之前4小时、之前3小时、之前2小时、之前1小时、之前30分钟、之前15分钟、之前10分钟、之前5分钟、或之前不到1分钟施用,则可以认为该第一成分在该第二成分“之前”施用。在其他实施方案中,可以在施用本发明的抗PD-1抗体之后对个体施用一种或多种附加的治疗活性成分。例如,如果第一成分在施用第二成分之后1分钟、之后5分钟、之后10分钟、之后15分钟、之后30分钟、之后1小时、之后2小时、之后3小时、之后4小时、之后5小时、之后6小时、之后12小时、之后24小时、之后36小时、之后48小时、之后60小时、之后72小时施用,则可以认为该第一成分在该第二成分“之后”施用。还在其他实施方案中,可以与施用本发明的抗PD-1抗体同时对个体施用一种或多种附加的治疗活性成分。为了本发明的目的,“同时”施用包括,例如,以单个剂型(例如,共同配制的)对个体施用抗PD-1抗体和附加的治疗活性成分,或以分开的剂型在彼此的约30分钟或更短时间内对个体施用。如果以分开的剂型施用,每种剂型可以经相同的途径施用(例如,抗PD-1抗体和附加的治疗活性成分二者都可以静脉内、皮下施用等);备选地,每种剂型可以经不同的途径施用(例如,抗PD-1抗体可以静脉内施用,而附加的治疗活性成分可以皮下施用)。为了本公开的目的,在任何情况下,以单个剂型、通过相同途径以分开的剂型或通过不同途径以分开的剂型施用成分全都视为“同时施用”。为了本公开的目的,将施用附加的治疗活性成分“之前”、“与之同时”或“之后”(如上文所定义的那些术语)施用抗PD-1抗体视为与附加的治疗活性成分“组合”施用抗PD-1抗体。本发明包括药物组合物,其中用多种剂量组合将本发明的抗PD-1抗体与本文中其他地方所述的一种或多种附加的治疗活性成分共同配制。在其中将本发明的抗PD-1抗体与VEGF拮抗剂(例如VEGFtrap,如阿柏西普)组合施用(包括施用含有抗PD-1抗体和VEGF拮抗剂的共同制剂)的示例性实施方案中,可以对个体施用单成分和\/或用多种剂量组合共同配制单成分。例如,可以对个体施用抗PD-1抗体,和\/或将抗PD-1抗体按选自0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg和10.0mg的量包含在共同制剂中;可以对个体施用VEGF拮抗剂(例如VEGFtrap,如阿柏西普),和\/或将VEGF拮抗剂按选自0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg和3.0mg的量包含在共同制剂中。可以按照本文中其他地方公开的任意施用方案对个体施用组合\/共同制剂,包括例如一周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次等。施用方案根据本发明的某些实施方案,可以在确定时程内对个体施用多个剂量的抗PD-1抗体(或包含抗PD-1抗体与本文提到的任意附加的治疗活性剂的组合的药物组合物)。本发明的这个方面的方法包括对个体顺次施用多个剂量的本发明的抗PD-1抗体。本文所用的“顺次施用”指在不同时间点对个体施用每个剂量的抗PD-1抗体,例如在相隔预定间隔(例如,小时、天、周或月)的不同天。本发明包括这样的方法,该方法包括对患者顺次施用单个起始剂量的抗PD-1抗体,然后施用一个或多个第二剂量的抗PD-1抗体,然后可选地施用一个或多个第三剂量的抗PD-1抗体。抗PD-1抗体可以按0.1mg\/kg至100mg\/kg之间的剂量施用。术语“起始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指施用本发明的抗PD-1抗体的时间顺序。因此,“起始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”);“第二剂量”是在起始剂量之后施用的剂量;而“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。起始、第二和第三剂量可以全都包含相同量的抗PD-1抗体,但通常可以在施用频率上彼此不同。但是,在某些实施方案中,包含在起始、第二和\/或第三剂量中的抗PD-1抗体的量在治疗过程中相互不同(例如,根据需要上调或下调)。在某些实施方案中,在治疗方案开始时施用两个或多个(例如2、3、4或5个)剂量作为“负荷剂量”,然后以较低频率施用后续剂量(例如“维持剂量”)。在本发明的某些示例性实施方案中,每个第二和\/或第三剂量在前一个剂量之后1至26(例如,1、11\/2、2、21\/2、3、31\/2、4、41\/2、5、51\/2、6、61\/2、7、71\/2、8、81\/2、9、91\/2、10、101\/2、11、111\/2、12、121\/2、13、131\/2、14、141\/2、15、151\/2、16、161\/2、17、171\/2、18、181\/2、19、191\/2、20、201\/2、21、211\/2、22、221\/2、23、231\/2、24、241\/2、25、251\/2、26、261\/2或更多)周施用。本文所用的短语“前一剂量”指在一系列多次施用中,按无居间剂量的顺序在施用紧接着的剂量之前对患者施用的抗PD-1抗体的剂量。本发明的这个方面的方法可以包括对患者施用任意数目的抗PD-1抗体的第二和\/或第三剂量。例如,在某些实施方案中,仅对患者施用单个第二剂量。在其他实施方案中,对患者施用两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第二剂量。同样,在某些实施方案中,仅对患者施用单个第三剂量。在其他实施方案中,对患者施用两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三剂量。在涉及多个第二剂量的实施方案中,每个第二剂量可以按与其他第二剂量相同的频率施用。例如,每个第二剂量可以在前一剂量之后1至2周或1至2个月对患者施用。类似地,在涉及多个第三剂量的实施方案中,每个第三剂量可以按与其他第三剂量相同的频率施用。例如,每个第三剂量可以在前一剂量之后2至12周对患者施用。在本发明的某些实施方案中,对患者施用第二和\/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中改变。取决于单个患者在临床检查后的需要,医生也可以在治疗过程中调整施用的频率。本发明包括这样的施用方案,其中按第一频率(例如每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两月一次等)对患者施用2至6个负荷剂量,然后按较低频率对患者施用两个或多个维持剂量。例如,按照本发明的这个方面,如果按例如每月一次的频率施用负荷剂量(例如,每月一次施用两个、三个、四个或更多个负荷剂量),则可以每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每十周一次、每十二周一次等对患者施用维持剂量。抗体的诊断用途本发明的抗PD-1抗体可以用于检测和\/或测量样品中的PD-1,例如用于诊断目的。一些实施方案考虑本发明的一种或多种抗体在检测疾病或障碍如癌症、自身免疫病或慢性病毒感染的测定中的用途。PD-1的示例性诊断测定可以包括,例如,使从患者获得的样品与本发明的抗PD-1抗体接触,其中该抗PD-1抗体用可检测标记或报告分子标记或用作捕获抗体来从患者样品选择性分离PD-1。备选地,可以将未标记的抗PD-1抗体与本身带有可检测标记的第二抗体组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可以是放射性核素,如3H、14C、32P、35S或125I;荧光或化学发光部分,如异硫氰酸荧光素或罗丹明;或酶,如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可以用于检测或测量样品中的PD-1的具体的示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。可以用于本发明的PD-1诊断测定的样品包括可从患者获得的任意组织或流体样品,其在正常或生理条件下包含可检测量的PD-1蛋白质或其片段。通常,将测量从健康患者(例如,未患癌症或自身免疫病的患者)获得的具体样品中PD-1的水平,以初步建立PD-1水平的基线或标准。然后将PD-1的此基线水平与在从疑似患有癌症相关病症或与这种病症相关的症状的个体获得的样品中测量的PD-1水平相比较。对PD-1特异的抗体可以不包含附加的标记或部分,或者它们可以包含N端或C端标记或部分。在一个实施方案中,该标记或部分是生物素。在结合测定中,标记(如果存在)的位置可以决定肽相对于该肽所结合的表面的取向。例如,如果用抗生物素蛋白包被表面,则包含N端生物素的肽将这样取向,使得该肽的C端部分将远离表面。本发明的方面涉及所公开的抗体作为用于在患者中预测癌症或自身免疫障碍的预后的标记的用途。本发明的抗体可以用于诊断测定来在患者中评价癌症的预后和预测存活期。实施例提出以下实施例,以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述,并非旨在限制发明人视为其发明的内容的范围。已努力确保所使用的数字的准确性(例如量、温度等),但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明,部分是按重量计的部分,分子量是平均分子量,温度以摄氏度表示,室温为约25℃,压力为大气压或近大气压。实施例1:抗PD-1的人抗体的产生用具有C93S改变的GenBank检索号NP_005009.2(SEQIDNO:327)的约25-170个氨基酸的PD-1片段,产生抗PD-1的人抗体。直接对包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的小鼠施用含佐剂的免疫原,以刺激免疫反应。通过PD-1特异性免疫测定监测抗体免疫反应。在达到希望得到的免疫反应时,收集脾细胞,并与小鼠骨髓瘤细胞融合,以保持其活率,并形成杂交瘤细胞系。筛选和选择杂交瘤细胞系,以鉴定产生PD-1特异性抗体的细胞系。使用此技术及上述免疫原,获得了七个抗PD-1嵌合抗体(即具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体);以这种方式产生的示例性抗体命名为H1M7789N、H1M7799N、H1M7800N、H2M7780N、H2M7788N、H2M7790N、H2M7791N、H2M7794N、H2M7795N、H2M7796N和H2M7798N。还按U.S.2007\/0280945A1中所述直接从未与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性B细胞分离了抗PD-1抗体,该专利在此明确完整引入作为参考。使用此方法,获得了七个全人抗PD-1抗体(即具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体);以这种方式产生的示例性抗体命名如下:H4H9019P、H4xH9034P2、H4xH9035P2、H4xH9037P2、H4xH9045P2、H4xH9048P2、H4H9057P2、H4H9068P2、H4xH9119P2、H4xH9120P2、H4xH9128P2、H4xH9135P2、H4xH9145P2、H4xH8992P、H4xH8999P和H4xH9008P。按照此实施例的方法产生的示例性抗体的生物学特性在下文所示的实施例中详细描述。实施例2:重链和轻链可变区氨基酸和核苷酸序列表1显示本发明所选择的抗PD-1抗体的重链和轻链可变区及CDR的氨基酸序列标识号。表2中显示对应的核酸序列标识号。表1:氨基酸序列标识号表2:核酸序列标识号本文中通常按以下命名提到抗体:Fc前缀(例如“H4xH”、“H1M”、“H2M”等),随后是数字识别号(例如“7789”、“7799”等,如表1中所示),随后是“P”、“P2”、“N”或“B”后缀。因此,按照此命名,本文中可将抗体称为例如“H1H7789N”、“H1M7799N”、“H2M7780N”等。本文所用的抗体命名上的H4xH、H1M、H2M和H2aM前缀表示抗体的具体Fc区同种型。例如,“H4xH”抗体具有US20100331527中所公开的含有2个或多个氨基酸改变的人IgG4Fc,“H1M”抗体具有小鼠IgG1Fc,“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc(a或b同种型)(如抗体命名中的第一个“H”所表示,所有可变区都是全人可变区)。如本领域普通技术人员将理解,可将具有具体Fc同种型的抗体转换为具有不同Fc同种型的抗体(例如,可以将具有小鼠IgG1Fc的抗体转换为具有人IgG4的抗体等),但在任何情况下,通过表1中所示数字标识号表示的可变结构域(包括CDR)将保持相同,且无论Fc结构域的性质如何,都预期对抗原的结合特性相同或基本相似。在某些实施方案中,将所选择的具有小鼠IgG1Fc的抗体转换为具有人IgG4Fc的抗体。在一个实施方案中,该IgG4Fc结构域在铰链区中包含丝氨酸至脯氨酸的突变(S108P),以促进二聚体稳定化。表3显示所选择的具有人IgG4Fc的抗PD-1抗体的重链和轻链序列的氨基酸序列标识号。表3表3中的每个重链序列包含可变区(VH或HCVR;包含HCDR1、HCDR2和HCDR3)和恒定区(包含CH1、CH2和CH3结构域)。表3中的每个轻链序列包含可变区(VL或LCVR;包含LCDR1、LCDR2和LCDR3)和恒定区(CL)。SEQIDNO:330包含含有氨基酸1-117的HCVR和含有氨基酸118-444的恒定区。SEQIDNO:331包含含有氨基酸1-107的LCVR和含有氨基酸108-214的恒定区。SEQIDNO:332包含含有氨基酸1-122的HCVR和含有氨基酸123-449的恒定区。SEQIDNO:333包含含有氨基酸1-107的LCVR和含有氨基酸108-214的恒定区。SEQIDNO:334包含含有氨基酸1-119的HCVR和含有氨基酸120-446的恒定区。SEQIDNO:335包含含有氨基酸1-108的LCVR和含有氨基酸109-215的恒定区。SEQIDNO:336包含含有氨基酸1-121的HCVR和含有氨基酸122-448的恒定区。SEQIDNO:337包含含有氨基酸1-108的LCVR和含有氨基酸109-215的恒定区。实施例3:通过表面等离振子共振测定的抗体与PD-1的结合在Biacore4000或BiacoreT200仪器上用实时表面等离振子共振生物传感测定,测量抗原与纯化的抗PD-1抗体结合的结合和解离速率常数(分别为ka和kd)、平衡解离常数和解离半衰期(分别为KD和t1\/2)。用多克隆兔抗小鼠抗体(GE,#BR-1008-38)或用单克隆小鼠抗人Fc抗体(GE,#BR-1008-39)衍生化Biacore传感器表面,以分别捕获约100-900RU带着小鼠Fc或人Fc表达的抗PD-1单克隆抗体。针对与抗PD-1抗体的结合测试的PD-1试剂包括带着C端myc-myc-六组氨酸标记表达的重组人PD-1(hPD-1-MMH;SEQIDNO:321)、带着C端myc-myc-六组氨酸标记表达的重组猕猴PD-1(MfPD-1-MMH;SEQIDNO:322)、带着C端小鼠IgG2aFc标记(hPD-1-mFc;SEQIDNO:323)或带着C端人IgG1Fc(hPD1-hFc;SEQIDNO:324)表达的重组人PD-1二聚体及带着mFc的猴PD-1。按Biacore4000上30μL\/分钟或BiacoreT200上50μL\/分钟的流速将从200nM至3.7nM范围内的不同浓度PD-1试剂注射在捕获了抗PD-1单克隆抗体的表面上。监测PD-1试剂与捕获的单克隆抗体的结合3至5分钟,而在HBST运行缓冲液(0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05%v\/v表面活性剂P20)中监测其从抗体解离7至10分钟。实验在25℃和37℃进行。通过用Scrubber2.0c曲线拟合软件处理并拟合数据至1:1结合模型来测定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。然后按以下从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1\/2):KD(M)=kd\/ka,t1\/2(分钟)=[ln2\/(60*kd)]。不同抗PD-1单克隆抗体与不同PD-1试剂在25℃和37℃下结合的结合动力学参数在表4-11中列表显示。表4:抗PD-1单克隆抗体在25℃与人PD-1-MMH结合的结合动力学参数*NB表示在实验条件下,PD-1试剂未与捕获的抗PD-1单克隆抗体结合。表5:抗PD-1单克隆抗体在37℃与人PD-1-MMH结合的结合动力学参数。*NB表示在实验条件下,PD-1试剂未与捕获的抗PD-1单克隆抗体结合。IC表示在实验条件下,PD-1结合不确定。表6:抗PD-1单克隆抗体在25℃与人PD-1二聚体(人PD-1-mFc或人PD-1-hFc)结合的结合动力学参数。表7:抗PD-1单克隆抗体在37℃与人PD-1二聚体(人PD-1-mFc或人PD-1-hFc)结合的结合动力学参数。表8:抗PD-1单克隆抗体在25℃与MfPD-1-MMH结合的结合动力学参数。*NB表示在实验条件下,PD-1试剂未与捕获的抗PD-1单克隆抗体结合。表9:抗PD-1单克隆抗体在37℃与MfPD-1-MMH结合的结合动力学参数。*NB表示在实验条件下,PD-1试剂未与捕获的抗PD-1单克隆抗体结合。IC表示在实验条件下,PD-1结合不确定。表10:抗PD-1单克隆抗体在25℃与猴PD-1二聚体(猴PD-1-mFc)结合的结合动力学参数。表11:抗PD-1单克隆抗体在37℃与猴PD-1二聚体(猴PD-1-mFc)结合的结合动力学参数。*表示在当前实验条件下,未观察到PD-1试剂的解离,将kd值手动固定在1.00E-05。如表4中所示,在25℃下,29种本发明的抗PD-1抗体中的28种以从2.1nM至291nM范围内的KD值结合hPD-1-MMH。一种抗体(H4H9068P2)在25℃下未显示与hPD-1-MMH的任何可测量的结合。如表5中所示,在37℃下,29种本发明的抗PD-1抗体中的26种以从3.79nM至1.51μM范围内的KD值结合hPD-1-MMH。三种本发明的抗体在37℃下未显示与hPD-1-MMH的任何确定的结合。如表6中所示,在25℃下,全部29种本发明的抗PD-1抗体以从65.5pM至59.4nM范围内的KD值结合hPD-1二聚体蛋白质。如表7中所示,在37℃下,全部27种本发明的抗PD-1抗体以从3.09pM至551nM范围内的KD值结合hPD-1二聚体蛋白质。如表8中所示,在25℃下,29种本发明的抗PD-1抗体中的27种以从3.09nM至551nM范围内的KD值结合MfPD-1-MMH。两种本发明的抗体在25℃下未显示与MfPD-1-MMH的任何确定的结合。如表9中所示,在37℃下,29种本发明的抗PD-1抗体中的25种以从7.00nM至7.54μM范围内的KD值结合MfPD-1-MMH。四种本发明的抗体在37℃下未显示与MfPD-1-MMH的任何确定的结合。如表10中所示,在25℃下,全部18种所测试的本发明的抗PD-1抗体以从137pM至54.2nM范围内的KD值结合MfPD-1二聚体。如表11中所示,在37℃下,全部18种所测试的本发明的抗PD-1抗体以从不到49pM至86.3nM范围内的KD值结合MfPD-1二聚体。实施例4:通过ELISA测定PD-1与PD-L1的结合的阻断用三种竞争夹心ELISA型式测量了抗PD-1抗体阻断人PD-1与其配体(PD-L1受体)结合的能力。将包含带着C端人Fc标记(hPD-L1-hFc;SEQID:325)或C端小鼠Fc标记(hPD-L1-mFc;SEQID:326)表达的部分人PD-L1胞外域的二聚体人PD-L1蛋白质、或包含带着C端人Fc标记产生的人PD-L2胞外区的二聚体人PD-L2(hPD-L2-hFc;R&DSystems,#1224-PL)分别按PBS中2μg\/mL的浓度4℃过夜包被在96孔微量滴定板上。然后用含0.5%(w\/v)BSA的PBS溶液封闭非特异性结合位点。在第一竞争型式中,将1.5nM恒定浓度的包含带着C端小鼠Fc标记表达的人PD-1胞外域的二聚体人PD-1蛋白质(hPD-1-mFc;SEQID:323)加至抗PD-1抗体或同种型对照抗体的系列稀释液,使得抗体终浓度在0至200nM的范围内。在第二竞争型式中,将200pM恒定浓度的包含带着C端人Fc标记表达的人PD-1胞外域的二聚体生物素化人PD-1蛋白质(biot-hPD-1-hFc;SEQID:323)类似地加至抗PD-1抗体或同种型对照的系列稀释液,抗体终浓度在0至50nM的范围内。在第三竞争型式中,将100pM恒定浓度的二聚体hPD-1-mFc蛋白质类似地加至抗PD-1抗体或同种型对照的系列稀释液,抗体终浓度在0至100nM的范围内。然后室温(RT)孵育这些抗体-蛋白质复合物1小时。具有1.5nM恒定hPD-1-mFc的抗体-蛋白质复合物转移至hPD-L1-hFc包被的微量滴定板,具有200pM恒定biot-hPD-1-hFc的抗体-蛋白质复合物转移至hPD-L1-mFc包被的微量滴定板,具有100pM恒定hPD-1-mFc的抗体-蛋白质复合物转移至hPD-L2-hFc包被的微量滴定板。RT孵育1小时后,洗涤孔,用缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗mFc多克隆抗体(JacksonImmunoResearchInc.,#115-035-164)检测板结合的hPD-1-mFc,用缀合HRP的链霉抗生物素蛋白(ThermoScientific,#N200)检测板结合的biot-hPD-1-hFc。用TMB溶液(BDBiosciences,#51-2606KC和#51-2607KC)显色样品,以产生比色反应,然后通过加入1M硫酸来稳定显色,然后在VictorX5酶标仪上测量450nm吸光度。用PrismTM软件(GraphPad)内的S形剂量-反应模型进行数据分析。用计算的IC50值(定义为使人PD-1与人PD-L1或PD-L2的结合减少50%所需的抗体浓度)作为阻断效力的指示。计算最大百分比阻断作为从剂量曲线测定的抗体在平板上完全阻断人PD-1与人PD-L1或PD-L2结合的能力的测量。通过以下计算此最大百分比阻断:从100%减去在每种抗体的最高测试浓度存在下观察到的信号降低相对以下差值的比例,该差值是针对不含抗PD-1抗体的人PD-1样品观察到的信号(0%阻断)与来自HRP缀合的二抗单独的背景信号(100%阻断)之间的差值。表12-14中显示阻断超过35%的hPD-1结合信号的抗体的最大百分比阻断和计算的IC50值。显示hPD-1结合信号减少35%或更少的抗体定义为非阻断剂。显示人PD-1结合信号增加35%或更多的抗体作为非阻断剂\/增强剂表征。理论测定底部(定义为在测定中占据50%的人PD-1结合部位理论上所需的最小抗体浓度)对于使用1.5nM恒定hPD-1-mFc的型式为0.75nM、对于使用200pM恒定biot-hPD-1-hFc的型式为100pM、对于使用100pM恒定hPD-1-mFc的型式为50pM,表明较低的IC50计算值可不代表定量性蛋白质-抗体部位结合。因此,具有在hPD-1-mFc恒定和hPD-L1包被的测定中小于0.75nM、在biot-hPD-1-hFc恒定和hPD-L1包被的测定中小于100pM及在hPD-1-mFc恒定和hPD-L2包被的测定中小于50pM的IC50计算值的抗体在表12-14中分别报告为<7.5E-10M、<1.0E-10M和<5.0E-11M。表12:抗PD-1抗体对人PD-1与人PD-L1的结合的ELISA阻断测定理论底部:对于hPD-1-mFc恒定和hPD-L1包被的阻断ELISA为7.5E-10M;(*)-低于测定的理论底部;NT-未测试;NBI-非阻断剂;NBI\/增强剂-非阻断剂\/增强剂;IC-不确定。表13:抗PD-1抗体对生物素化人PD-1与人PD-L1的结合的ELISA阻断测定理论底部:对于biot-hPD-1-mFc恒定和hPD-L1包被的阻断ELISA为1.0E-10M;(*)-低于测定的理论底部;NT-未测试;NBI-非阻断剂;NBI\/增强剂-非阻断剂\/增强剂;IC-不确定。表14:抗PD-1抗体对人PD-1与人PD-L2的结合的ELISA阻断测定理论底部:对于hPD-1-mFc恒定和hPD-L2包被的阻断ELISA为5.0E-11M;NBI-非阻断剂。如表12中所示,在第一测定型式中,27种抗PD-1抗体中的23种阻断1.5nMhPD-1-mFc与hPD-L1-hFc的结合,IC50值在190pM至3.3nM的范围内,最大百分比阻断在67%至100%的范围内。将一种抗体(H2aM7796N)鉴定为非阻断剂。将三种抗PD-1抗体(H4H9068P2、H1M7789N和H2aM7791N)鉴定为非阻断剂\/增强剂。如表13中所示,在第二测定型式中,27种抗PD-1抗体中的23种阻断200pMbiot-hPD-1-hFc与hPD-L1-mFc的结合,IC50值在59pM至1.3nM的范围内,最大百分比阻断在60%至101%的范围内。将一种抗体(H1M7789N)鉴定为非阻断剂。将三种抗PD-1抗体(H4H9057P2、H4H9068P2和H2aM7791N)鉴定为非阻断剂\/增强剂。如表14中所示,在第三测定型式中,测试了四种本发明的抗PD-1抗体和同种型对照。全部4种本发明的抗PD-1抗体都阻断100pM(固定浓度)hPD-1-mFc与包被平板的hPD-L2-hFc的结合,IC50值在0.13nM至1.3nM的范围内,最大百分比阻断在94%至100%的范围内。实施例5:通过生物传感器测定和通过表面等离振子共振测定的PD-1与PD-L1结合的阻断在OctetRed96生物传感仪(FortebioInc.)上用实时生物膜层干涉测定或在Biacore3000仪器上用实时表面等离振子共振生物传感测定研究了不同抗PD-1单克隆抗体对人PD-1与人PD-L1结合的抑制。在OctetRed96仪器上进行了带着小鼠Fc表达的抗PD-1单克隆抗体的抑制研究。首先,将100nM带着C端小鼠IgG2aFc标记表达的重组人PD-1(hPD-1-mFc;SEQIDNO:323)与500nM的每种抗PD-1单克隆抗体孵育至少1小时,然后运行抑制测定。用抗人IgGFc捕获Octet传感器捕获约0.8nm至1.2nm带着C端人IgG1Fc标记表达的重组人PD-L1(hPD-L1-hFc;SEQIDNO:325)。然后将hPD-L1-hFc包被的Octet传感器浸入含有hPD-1-mFc和不同的抗PD-1单克隆抗体的混合物的孔中。整个实验在25℃下在OctetHBST缓冲液(0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05%v\/v表面活性剂P20、0.1mg\/mLBSA)中进行,平板按1000转\/分钟的速度震荡。在实验的每个步骤之间在OctetHBST缓冲液中洗涤生物传感器。在整个实验过程中监测实时结合反应,记录每个步骤结束时的结合反应。在存在和缺乏不同的抗PD-1单克隆抗体的情况下比较hPD-1-mFc与捕获的hPD-L1-hFc的结合,并用于确定表15中所示的测试抗体的阻断行为。表15:在OctetRed96仪器上测量的带着小鼠Fc表达的抗PD-1单克隆抗体对人PD-L1与PD-1结合的抑制如表15中所示,在OctetRed96仪器上测试的11种抗PD-1抗体中的9种显示强烈阻断hPD-1-mFc与hPD-L1-hFc的结合,在从86%至完全阻断结合的范围内。所测试的一种抗PD-1抗体(H1M7789N)显示较弱地阻断hPD-1-mFc与hPD-L1-hFc的结合,阻断了29%。所测试的一种抗体(H2aM7791N)显示增强hPD-1-mFc与hPD-L1-hFc结合的能力。然后,在Biacore3000仪器上进行了带着人Fc表达的抗PD-1单克隆抗体的抑制研究。首先,将100nM带着C端人IgG1Fc标记表达的重组人PD-1(hPD-1-hFc;SEQID:324)与500nM的每种抗PD-1单克隆抗体孵育至少2小时,然后运行抑制测定。首先用标准EDC-NHS化学品,用多克隆兔抗小鼠抗体(GECatalog#BR-1008-38)衍生化CM5Biacore传感器表面。然后捕获约730RU带着C端小鼠IgG2aFc标记表达的重组人PD-L1(hPD-L1.mFc;SEQID:326),然后按25μL\/分钟的流速在存在和缺乏不同的抗PD-1单克隆抗体的情况下注入100nMhPD-1.hFc3分钟。整个实验在25℃下在包含0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05%v\/v表面活性剂吐温-20的运行缓冲液(HBS-ET运行缓冲液)中进行。在整个实验过程中监测实时结合反应,记录每个步骤结束时的结合反应。在存在和缺乏不同的抗PD-1单克隆抗体的情况下比较hPD-1-hFc与捕获的hPD-L1-mFc的结合,并用于确定表16中所示的测试抗体的阻断行为。表16:在Biacore3000仪器上测量的带着人Fc表达的抗PD-1单克隆抗体对人PD-L1与PD-1结合的抑制如表16中所示,在Biacore3000仪器上测试的20种抗PD-1抗体中的18种显示强烈阻断hPD-L1-hFc与hPD-1-mFc的结合,阻断在从96%至100%的范围内。一种抗体显示增强hPD-1-hFc与hPD-L1-mFc的结合的能力。在此研究中,所测试的一种本发明的抗体(H4H9057P2)显示与抗小鼠Fc捕获表面的非特异性背景结合。实施例6:抗PD-1抗体间的Octet交叉竞争在OctetRED384生物传感器(PallForteBioCorp.)上用实时、无标记生物膜层干涉测定,测量了抗PD-1单克隆抗体间的结合竞争。整个实验在25℃下在0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05%v\/v表面活性剂吐温-20、0.1mg\/mLBSA(OctetHBS-ET缓冲液)中进行,平板按1000转\/分钟的速度震荡。为了评估两种抗体是否能够相互竞争结合其各自在具有C端myc-myc-六组氨酸标记的重组表达的人PD-1(hPD-1-MMH;SEQID:321)上的表位,首先通过将探头浸入含有50μg\/mLhPD-1-MMH溶液的孔中5分钟来将约0.1nM的hPD-1-MMH捕获在抗六组氨酸抗体包被的Octet生物传感探头(PallForteBioCorp.,#18-5079)上。然后通过浸入含有50μg\/mL第一抗PD-1单克隆抗体(后文称为mAb-1)溶液的孔中5分钟,来用mAb-1饱和抗原包被(captured)的生物传感探头。然后将生物传感探头浸入含有50μg\/mL第二抗PD-1单克隆抗体(后文称为mAb-2)溶液的孔中。在每个实验步骤之间在OctetHBS-ET缓冲液中洗涤生物传感探头。在整个实验过程中监测实时结合反应,记录每个步骤结束时的结合反应。比较mAb-2结合预先与mAb-1复合的hPD-1-MMH的反应,并确定不同抗PD-1单克隆抗体的竞争\/非竞争行为。结果总结在表17中(*自我竞争的mAb2未列出)。表17:所选择的抗PD-1抗体对之间的交叉竞争在OctetHTX生物传感器(PallForteBioCorp.)上用实时、无标记生物膜层干涉测定,测量了一系列所选择的抗PD-1单克隆抗体之间的第二结合竞争。整个实验在25℃下在0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05%v\/v表面活性剂吐温-20、0.1mg\/mLBSA(OctetHBS-ET缓冲液)中进行,平板按1000转\/分钟的速度震荡。为了评估两种抗体是否能够相互竞争结合其各自在hPD-1-MMH上的表位,首先通过将探头浸入含有10μg\/mLhPD-1-MMH溶液的孔中150秒来将约0.25nm的hPD-1-MMH捕获在抗六组氨酸抗体包被的Octet生物传感探头(FortebioInc,#18-5079)上。然后通过浸入含有100μg\/mL第一抗PD-1单克隆抗体(后文称为mAb-1)溶液的孔中5分钟来用mAb-1饱和抗原包被的生物传感探头。然后将生物传感探头浸入含有100μg\/mL第二抗PD-1单克隆抗体(后文称为mAb-2)溶液的孔中4分钟。在每个实验步骤之间在OctetHBS-ET缓冲液中洗涤所有生物传感探头。在整个实验过程中监测实时结合反应,按图2中所示记录每个步骤结束时的结合反应。比较mAb-2结合预先与mAb-1复合的hPD-1-MMH的反应,并确定不同抗PD-1单克隆抗体的竞争\/非竞争行为。结果总结在表18中(*自我竞争的mAb2未列出)。表18:所选择的抗PD-1抗体对之间的交叉竞争所应用的第一抗体(“mAb1”)显示与mAb1竞争的mAb2抗体*H4H7795N2H4H7798NH4H7798NH4H7795N2、H4H9008PH4H9008PH4H7798N、H4H9068P2H4H9068P2H4H9008P、H4H9048P2H4H9048P2H4H9068P2在本实施例中公开的实验条件下,H4H7795N2与H4H7798N交叉竞争,H4H7798N与H4H7795N2和H4H9008P,H4H9008P与H4H7798N和H4H9068P2交叉竞争,H4H9068P2与H4H9008P和H4H9048P2交叉竞争。实施例7:结合过量表达PD-1的细胞的抗体通过FACS测定了抗PD-1抗体与稳定转染全长人PD-1(检索号NP_005009.2的氨基酸1至289)的人胚肾细胞系(HEK293;ATCC,#CRL-1573)(HEK293\/hPD-1)的结合。对于该测定,用胰蛋白酶或无酶解离缓冲液脱附贴壁细胞,并用完全培养基阻断。离心细胞,并按2.5-6x10^6细胞\/mL重悬在含2%FBS的冷PBS中。然后用100nM的每种抗PD-1抗体冰上孵育HEK293亲本细胞和HEK293\/hPD-1细胞15-30分钟。通过用含2%FBS的D-PBS洗涤来去除未结合的抗体,随后用识别人Fc(JacksonImmunoResearch,#109-136-170)或小鼠Fc(JacksonImmunoResearch,#115-136-146)的别藻蓝蛋白缀合第二F(ab’)2冰上孵育细胞15-30分钟。用含2%FBS的D-PBS洗涤细胞以去除未结合的第二F(ab’)2,用HyperCyte(IntelliCyt,Inc.)流式细胞仪或Accuri流式细胞仪(BDBiosciences)获取荧光测量结果。用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。表19:抗PD-1抗体与HEK293\/hPD-1细胞和亲本HEK293细胞的FACS结合如表19中所示,与亲本HEK293细胞系上的结合相比,27种本发明的抗PD-1抗体中的25种显示强烈结合HEK293\/hPD-1细胞。与所测试的其他抗体相比,两种本发明的抗体(H2aM7795N和H4H9068P2)与表达人PD-1的细胞结合较弱。为了进一步表征本发明的抗PD1抗体,通过FACS测定了与稳定转染全长人PD-1(检索号NP_005009.2的氨基酸1至289)的人胚肾细胞系(HEK293;ATCC,#CRL-1573)(HEK293\/hPD-1)的剂量依赖性结合。对于该测定,用胰蛋白酶脱附贴壁细胞,并用完全培养基阻断。离心细胞,并按6x10^6细胞\/mL重悬在染色缓冲液(含1%FBS的PBS)中。为了测定抗PD1抗体的EC50和Emax,用在染色缓冲液中稀释至5pM至100nM范围内的终浓度的抗PD-1抗体和对照的系列稀释液(未包括mAb样品作为阴性对照)冰上孵育90uL细胞悬液30分钟。然后离心细胞,并用染色缓冲液洗涤沉淀一次以去除未结合的抗体。然后用识别人Fc(JacksonImmunoResearch,#109-136-170)或小鼠Fc(JacksonImmunoResearch,#115-136-146)的别藻蓝蛋白缀合第二F(ab’)2冰上孵育细胞30分钟。离心细胞,并用染色缓冲液洗涤沉淀一次以去除未结合的第二F(ab’)2,然后用Cytofix(BDBiosciences,#554655)和染色缓冲液的1:1稀释液过夜固定。第二天,离心细胞,用染色缓冲液洗涤一次,重悬,并过滤。在流式细胞仪上获取荧光测量结果,并在ForeCytTM(IntelliCyt;Albuquerque,NM)中分析,以确定平均荧光强度(MFI)。用GraphPadPrism从11点反应曲线的四参数逻辑斯蒂方程计算EC50值。每种抗体的Emax定义为所测试的最高抗体剂量(100nM)下的结合。表20:抗PD-1抗体与HEK293\/hPD-1细胞的剂量依赖性FACS结合表21:抗PD-1抗体与HEK293\/hPD-1细胞的剂量依赖性FACS结合如表20中所示,28种本发明的抗PD-1抗体中的25种显示与HEK293\/hPD-1细胞的剂量依赖性结合,EC50值在33.18pM至2.59nM的范围内,Emax值在37,789至11,368MFI的范围内。三种本发明的抗PD1抗体未显示与HEK293\/hPD-1细胞的强烈结合,因此不能确定EC50值。没有一个同种型对照在此测定中显示任何可测量的结合。如表21中所示,6种本发明的抗PD-1抗体中的3种显示与HEK293\/hPD-1细胞的剂量依赖性结合,EC50值在509pM至4.81nM的范围内,Emax值在39,774至14,111MFI的范围内。所测试的三种本发明的抗体结合HEK293\/hPD-1细胞,但未达到平台。因此不能确定其精确EC50值,将其EC50值称为不确定。没有一个同种型对照在此测定中显示任何可测量的结合。实施例8:T细胞\/APC萤光素酶报告基因测定中PD-1诱导的T细胞下调的阻断通过刺激识别由抗原呈递细胞(APC)上的I类或II类主要组织相容性复合体呈递的特异性抗原的T细胞受体(TcR)达到T细胞活化。激活的TcR转而起始可通过报告基因监测的信号级联放大事件,该报告基因由诸如激活蛋白1(AP-1)、活化的T细胞的核因子(NFAT)或活化的B细胞的核因子κ轻链增强子(NFκb)的转录因子驱动。T细胞反应通过进行(engagement)T细胞上组成性或诱导性表达的共同受体来调节。一个这种受体是PD-1,PD-1是T细胞活性的负调节物。PD-1与其表达在包括APC或癌细胞的靶细胞上的配体PD-L1相互作用,并通过招募磷酸酶至TcR信号转导体(signalosome)发挥作用来传递抑制信号,导致正信号发放的抑制。用图1中所示的基于细胞的体外测定评估了抗PD-1抗体在人T细胞系中通过PD-1受体拮抗PD-1\/PD-L1介导的信号发放的能力。通过利用源自两个哺乳动物细胞系Jurkat细胞(永生化T细胞系)和Raji细胞(B细胞系)的混合培养物,开发了生物测定来测量由APC和T细胞之间的相互作用诱导的T细胞信号发放。对于该生物测定的第一成分,按照厂家说明书用CignalLentiAP-1LucReporter(Qiagen–Sabiosciences,#CLS-011L)转导Jurkat克隆E6-1细胞(ATCC,#TIB-152)。慢病毒在最小CMV启动子、TPA诱导型转录反应元件(TRE)的串联重复序列和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因的控制下编码萤火虫萤光素酶基因。随后用包含人PD-1胞外域(人PD1的氨基酸1至170;检索号NP_005009.2)和人CD300a跨膜及胞质结构域(人CD300a的氨基酸181至299;检索号NP_009192.2)的PD-1嵌合体转导经改造的Jurkat细胞系。在补充500ug\/mLG418+1ug\/mL嘌呤霉素的RPMI\/10%FBS\/青霉素\/链霉素\/谷氨酰胺中选择和维持得到的稳定细胞系(Jurkat\/AP1-Luc\/hPD1-hCD300a)。对于该生物测定的第二成分,用已克隆入慢病毒(pLEX)载体系统(ThermoScientificBiosystems,#OHS4735)的人PD-L1基因(检索号NP_054862.1的氨基酸1-290)转导Raji细胞(ATCC,#CCL-86)。通过使用PD-L1抗体的FACS分离PD-L1阳性Raji细胞(Raji\/hPD-L1),并维持在补充了1ug\/mL嘌呤霉素的Iscove\/10%FBS\/青霉素\/链霉素\/谷氨酰胺中。为了刺激APC\/T细胞相互作用,利用了双特异性抗体,该双特异性抗体包含一条结合T细胞上的CD3的Fab臂和另一条结合Raji细胞上的CD20的Fab臂(CD3xCD20双特异性抗体,例如,如US20140088295中所公开)。双特异性分子在测定中的存在导致通过将T细胞上的CD3亚基桥接至Raji细胞上内源表达的CD20而活化T细胞和APC。已证明CD3与抗CD3抗体的连接导致T细胞活化。在此测定中,阻断PD1\/PD-L1相互作用的抗体通过使抑制信号失效并在随后导致AP1-Luc活化增加来挽救T细胞活性。在基于萤光素酶的生物测定中,用补充了10%FBS和青霉素\/链霉素\/谷氨酰胺的RPMI1640作为测定培养基制备细胞悬液和抗体稀释液来进行抗PD1单克隆抗体(mAb)的筛选。在筛选当天,测定抗PD1mAb在固定浓度的CD3xCD20双特异性抗体(30pM)存在下的EC50值,以及双特异性抗体单独的EC50值。按以下顺序,将细胞和试剂加至96孔板白色平底板。对于抗PD1mAbEC50测定,首先制备固定浓度的CD3xCD20双特异性抗体(终浓度30pM),并加至微量滴定板孔。然后加入抗PD1mAb和对照的12点系列稀释液(终浓度在1.7pM至100nM的范围内;加上仅有测定培养基的孔)。对于双特异性抗体(单独)EC50测定,将终浓度在0.17pM至10nM的范围内的双特异性抗体(加上仅有测定培养基的孔)加至微量滴定板孔。然后,制备2.5x10^6\/mLRaji\/hPD-L1细胞悬液,按每孔20uL加入(最终细胞数\/孔为5x10^4细胞)。平板室温放置(15-20分钟),同时制备2.5x10^6\/mL的Jurkat\/AP1-Luc\/hPD1(ecto)-hCD300a(TM-Cyto)悬液。每孔加入20uLJurkat悬液(最终细胞数\/孔为5x10^4细胞)。含有共培养物的平板在37℃\/5%CO2下孵育5至6小时。一式两份地测试样品,然后在加入ONE-GloTM(Promega,#E6051)试剂后检测萤光素酶活性,并在Victor发光计上测量相对光单位(RLU)。通过设定测定条件来归一化所筛选的每种抗体的RLU值,含有固定(30pM)浓度的CD3\/CD20双特异性抗体但不含抗PD-1抗体设为100%。此条件对应于在PD-1\/PD-L1抑制信号存在下由双特异性抗体引出的最大AP1-Luc反应。在加入抗PD-1抗体时,抑制信号受阻抑,增加的刺激在此显示为Emax(所测试的最高抗体剂量(100nM)存在下信号的百分比增加)。为了比较所测试的抗PD-1抗体的效力,用GraphPadPrism从12点反应曲线的四参数逻辑斯蒂方程确定归一化的RLU值达到150%激活时的抗体浓度。结果分别总结在表22和表23中。表22:抗PD1抗体在实验1中阻断AP1-Luc信号发放的PD-1\/PD-L1依赖性抑制N\/A=因这些抗体在所测试的浓度下未激活150%而不适用。表23:抗PD1抗体在实验2中阻断AP1-Luc信号发放的PD-1\/PD-L1依赖性抑制N\/A=因这些抗体在所测试的浓度下未激活150%而不适用。如表22中所示,所测试的31种本发明的抗PD-1抗体中的25种阻断PD-1\/PD-L1抑制,Emax值在239至163的范围内。在此测定中测试时,31种本发明的抗PD-1抗体中的6种未显示实质性阻断PD1\/PD-L1相互作用。如表23中所示,所测试的4种本发明的抗PD-1抗体中的2种阻断PD-1\/PD-L1抑制,Emax值分别为150%和343%。在此测定中测试时,4种本发明的抗PD-1抗体中的2种未显示实质性阻断PD1\/PD-L1相互作用。实施例9:抗PD-1抗体的体内效能为了测定选定数量的本发明的抗PD-1抗体在相关体内模型中的作用,在小鼠中进行了涉及皮下注射肿瘤细胞并在不同天开始的三项MC38.ova肿瘤生长研究,该小鼠在75%C57\/Bl6\/25%129品系背景上纯合表达人PD-1胞外域替代小鼠PD-1胞外域(PD-1HumIn小鼠)。对于该研究,按照体重将小鼠均匀分为用于研究1的5个治疗或对照组(每组5只小鼠)、用于研究2的8个治疗或对照组(每组5只小鼠)和用于研究3的5个治疗或对照组(每组7只小鼠)。在第0天,通过异氟醚吸入来麻醉小鼠,然后在右胁腹皮下注射悬浮在100uLDMEM中的5x105个MC38.ova细胞(对于研究1)或悬浮在100uLDMEM中的1x106个MC38.ova细胞(对于研究2和3)。对于研究1,治疗组在实验的第3、7、10、14和17天腹腔内注射200ug三种本发明的抗PD-1抗体中的任一种或具有不相关特异性的同种型对照抗体,而一组小鼠不进行治疗。对于研究2,治疗组在实验的第3、7、10、14和17天腹腔内注射每个剂量10mg\/kg或5mg\/kg的三种本发明的抗PD-1抗体中的任一种、每个剂量10mg\/kg的一种本发明的抗体(H4H7795N2)、或10mg\/kg的具有不相关特异性的同种型对照抗体。对于研究3,治疗组在实验的第3、7、10、14和17天腹腔内注射每个剂量5mg\/kg或2.5mg\/kg的两种本发明的抗PD-1抗体中的任一种、或5mg\/kg的具有不相关特异性的同种型对照抗体。表24中显示用于小鼠组的实验性给药和治疗方案。表24:用于小鼠组的实验性给药和治疗方案对于该研究,记录每个治疗组每个实验第14或17天和第23或24天的通过卡尺测量测定的平均肿瘤体积和百分比存活。此外,还在研究结束时(研究1为第42天,研究2和3为第31天)评估无肿瘤小鼠数。表示为平均肿瘤体积(mm3)(±SD)、百分比存活和无肿瘤小鼠数的结果显示在表23(研究1)、表3(研究2)和表4(研究3)中。表25:来自体内肿瘤研究1的每个治疗组中的平均肿瘤体积、百分比存活和无肿瘤小鼠数如表25中所示,对于研究1,用一种本发明的抗体H4H7798N治疗的小鼠在研究过程中未发展出任何可检测到的肿瘤。在研究的第17和24天,与对照相比,用H4H9008P治疗的小鼠显示持续减小的肿瘤体积,在实验结束时,5只小鼠中的3只或5只小鼠中的4只无肿瘤。相反,与对照相比,用抗PD-1抗体之一的H4H7795N2治疗在此研究中未显示减小肿瘤体积的显著效能。在研究的第23天,H4H7795N2组5只小鼠中的1只死亡,同种型对照治疗组5只小鼠中的2只死亡。在非治疗组和同种型对照组中,一些小鼠显示肿瘤自发消退(分别为5只小鼠中的1只和5只小鼠中的2只)。表26:来自体内肿瘤研究2的每个治疗组中的平均肿瘤体积、百分比存活和无肿瘤小鼠数如表26中所示,对于研究2,按10mg\/kg用一种本发明的抗体H4H7798N治疗的小鼠在研究过程中未发展出可检测到的肿瘤。在研究的第17和24天,与对照相比,用10mg\/kg的H4H9008P或H4H9048P2治疗的小鼠组显示实质性减小的肿瘤体积。在第31天,用10mg\/kg的H4H9008P或H4H9048P2治疗的每个组5只小鼠中的4只无肿瘤,而同种型对照治疗组5只小鼠中仅有1只由于自发肿瘤消退而无肿瘤。在研究的第17和24天,与对照相比,按10mg\/kg测试的一种抗体H4H7795N2显示实质性减小的肿瘤体积,但此抗体是效能最低的抗PD1抗体,在实验结束时5只小鼠中仅有2只存活。在用H4H7798N、H4H9008P和H4H9048P2治疗的组中观察到了测试剂量(5mg\/kg和10mg\/kg)下肿瘤抑制的剂量依赖性反应。5mg\/kg的H4H7798N或H4H9008P治疗效能较差,在第21天实验结束时5只小鼠中的4只是无肿瘤小鼠,而在H4H7798N和H4H9008P的10mg\/kg剂量这两个组中,5只小鼠中的5只保持无肿瘤。双因素方差分析多重比较中的Dunett检验显示,用10mg\/kg同种型对照抗体治疗作为参考的组和用10mg\/kgH4H7798N、H4H9008P或H4H9048P2治疗的组之间肿瘤生长的差异在统计上显著,p值<0.005。用10mg\/kg同种型对照抗体治疗作为参考的组和用5mg\/kgH4H7798N、H4H9008P或H4H9048P2治疗的组之间肿瘤生长的差异在统计上也显著,p值<0.05。表27:来自体内肿瘤研究3的每个治疗组中的平均肿瘤体积、百分比存活和无肿瘤小鼠数如表27中所示,对于研究3,按5mg\/kg用一种本发明的抗体H4H7798N或另一种本发明的抗体H4H9008P治疗的7只小鼠中的6只在实验结束时无肿瘤,而同种型对照组中没有无肿瘤的动物。IgG4对照组中的一只荷瘤鼠在植入后第17天死亡。按2.5mg\/kg剂量用H4H9008P治疗的7只小鼠中只有4只在实验结束时保持无肿瘤。如通过具有Dunnett多重比较事后检验的单因素方差分析所确定,所测试的抗PD-1抗体和同种型对照组之间第21天的肿瘤体积的差异在统计上显著,p<0.01。全部四种抗PD-1抗体都同等地在5mg\/kg剂量下比在2.5mg\/kg剂量下更有效。实施例10:抗PD-1抗体和VEGF拮抗剂的组合在小鼠早期治疗肿瘤模型中的抗肿瘤作用开发了早期治疗肿瘤模型来测试抗PD-1抗体和VEGF拮抗剂的组合的效能(efficacy)。自此模型中,在肿瘤植入后立即施用联合疗法。实验还单独使用抗PD-L1抗体,及与VEGF拮抗剂组合使用抗PD-L1抗体。用于此实验的抗PD-1抗体是具有大鼠IgG2b的抗小鼠PD-1克隆“RPMI-14”(BioXCell,WestLebanon,NH)。用于此实验的VEGF拮抗剂是阿柏西普(aflibercept,基于VEGF受体的嵌合分子,也称为“VEGF-trap”或“VEGFR1R2-FcΔC1(a)”,其完整描述在本文中其他地方提供)。用于此实验的抗PD-L1抗体是具有US20100203056A1(Genentech,Inc.)的抗体“YW243.55S70”的VH\/VL序列的抗PD-L1单克隆抗体,其具有小鼠IgG2a,且与小鼠PD-L1交叉反应。对于此实验模型,在第0天将1.0x106个Colon-26肿瘤细胞皮下植入BALB\/c小鼠。从第3天开始,在建立起可测量到的肿瘤之前,用表28中所示的单一治疗或联合治疗或对照组合治疗小鼠。表28:实验性给药和治疗组在为期两周的五个不同时间点施用多种治疗(即在第3天、第6天、第10天、第13天和第19天注射)。在第50天就肿瘤发生率、肿瘤体积、中位存活时间和无肿瘤动物数评价每个治疗组中的动物。肿瘤生长程度总结在图2(肿瘤生长曲线)和图3(第28天的肿瘤体积)中。结果还总结在表29中。表29:治疗组中的无肿瘤小鼠治疗组第50天的无肿瘤动物数对照组合0\/10只有VEGFTrap3\/10只有抗PD-14\/10只有抗PD-L15\/10VEGFTrap+抗PD-17\/10VEGFTrap+抗PD-L19\/10与涉及任一种治疗剂单独的治疗方案相比,用VEGFTrap+抗PD-1抗体的组合治疗的动物中肿瘤生长实质性减少(参见图2和3)。此外,VEGFTrap+抗PD-1抗体组中存活期实质性增加,70%的动物存活至肿瘤植入后至少第50天。相反,对于抗PD-1和VEGFTrap单一治疗组,仅分别有40%和30%存活至第50天(参见图3和表29)。实施例11:晚期恶性肿瘤患者中抗PD-1抗体作为单一治疗及与其他抗癌治疗联合反复给药的临床试验研究这是一项抗PD-1抗体单独或与放疗、环磷酰胺或与这二者联合在晚期恶性肿瘤患者中的剂量递增研究。用于此实施例的示例性抗PD-1抗体(“mAb”)包含SEQIDNO:162的HCVR和SEQIDNO:170的LCVR。研究目标本研究的主要目标是表征作为单一治疗或与靶向放射(旨在以此作为免疫刺激而不是主要作为肿瘤烧蚀(ablative)治疗)、低剂量环磷酰胺(显示已知调节T细胞反应的治疗)、或与这二者联合IV施用的mAb在晚期恶性肿瘤患者中的安全性、耐受性、DLT。本研究的次要目标是:(1)确定mAb作为单一治疗及与其他抗癌治疗(靶向放射、低剂量环磷酰胺或二者)联合的推荐2期剂量(RP2D);(2)描述mAb单独及与各搭档联合的初步抗肿瘤活性;(3)表征mAb作为单一治疗及与其他抗癌治疗(靶向放射、低剂量环磷酰胺或二者)联合的PK;和(4)评估mAb的免疫原性。研究设计安全性将在分开的标准3+3剂量递增群组中评估(在单一治疗、与放疗联合、与环磷酰胺联合及与放疗加环磷酰胺联合中)。与放疗、环磷酰胺或与这二者联合治疗的选择将基于研究者与发起者针对个体患者协商作出的最佳治疗选择的评估。为登记进入放疗群组,患者必须具有可安全照射的病灶,且对于该病灶,认为按所考虑的有限的姑息剂量照射在医学上适当,且至少一个其他病灶适合用于反应评价。只有在群组中有位置可用于所选择的治疗时,才允许患者登记。患者将在初次施用mAb之前的28天内进行筛查流程来确定是否合格。在登记患者入mAb单一治疗群组之后,后续群组的登记将由前一群组中DLT的发生率(即3名患者的群组中无DLT,或6名患者的扩大群组中不超过1例DLT)和患者位置的可用性决定。计划的单一治疗剂量水平是每14天(2周)IV施用1、3或10mg\/kg。1mg\/kg或3mg\/kgmAb单一治疗群组中的一个或两个的DLT观察期结束,而3名患者的群组中无DLT或6名患者的扩大群组中DLT不超过1例时,可登记患者进入环磷酰胺或放疗与该单一治疗剂量水平的mAb联合的群组。该mAb剂量水平+环磷酰胺的群组和该mAb剂量水平+同一放疗方案的群组二者的DLT观察期都结束,而3名患者的群组中无DLT或6名患者的扩大群组中DLT不超过1例时,可登记患者进入联合mAb+环磷酰胺\/放疗群组。3mg\/kgmAb单一治疗群组DLT观察期结束,而3名患者的群组中无DLT或6名患者的扩大群组中DLT不超过1例时,还可以登记10mg\/kgmAb单一治疗群组。只有在之前的单一治疗群组(即分别为1mg\/kg和3mg\/kg)中必要数量的患者完成28天DLT观察期而未显示该剂量水平的最大耐受剂量(MTD)之后,才可登记mAb3mg\/kg和10mg\/kg单一治疗群组。只有在1mg\/kg单一治疗群组的DLT观察期结束之后,才可登记mAb1mg\/kg联合治疗群组。只有在该1mg\/kgmAb联合群组中必要数量的患者完成DLT观察期而未显示MTD时才可登记接受3mg\/kgmAb的联合群组。只有在该剂量水平的两个相应的双重联合群组中必要数量的患者完成DLT观察期而未显示MTD时,才可登记mAb与环磷酰胺和放射方案联合的三重联合群组。表30总结将登记患者进入其中的剂量递增群组表30:可能的剂量递增群组n可能的分配治疗群组3–60.3mg\/kgmAb单一治疗(仅在MTD<1mg\/kgmAb时登记)3–61mg\/kgmAb单一治疗3–63mg\/kgmAb单一治疗a)3–610mg\/kgmAb单一治疗b)3–61mg\/kga)mAb+放疗(6Gy×5)3–61mg\/kga)mAb+放疗(9Gy×3)3–63mg\/kgb)(或MTD)mAb+环磷酰胺3–63mg\/kgb)(或MTD)mAb+放疗(6Gy×5)3–63mg\/kgb)(或MTD)mAb+放疗(9Gy×3)3–63mg\/kgb)(或MTD)mAb+放疗(6Gy×5)+环磷酰胺3–63mg\/kgb)(或MTD)mAb+放疗(9Gy×3)+环磷酰胺DLT定义为以下任一个:非血液毒性(例如葡萄膜炎或任意其他irAE),或血液毒性(例如中性白细胞减少、血小板减少、发热性中性白细胞减少)。最大耐受剂量(MTD)定义为6名患者的扩大群组的不到三分之一在第一治疗周期期间出现DLT的最高剂量。因此,MTD定义为刚好低于由于在6名患者的扩大群组中发生2例或多例DLT而终止给药的水平的剂量水平。如果剂量递增未由于发生DLT而终止,则将认为MTD未得到确定。对于单一治疗组或对于单个联合组,此研究中可能不能确定MTD。此外,mAbMTD可能在单一治疗和每种联合治疗方案之间不同。研究持续时间患者将接受至多48周治疗,然后将有24周随访期。患者将接受治疗,直至48周治疗期结束,或直至疾病进展、不可接受的毒性、撤回知情同意书、或满足另一研究退出标准。最少24周治疗后,确认完全反应(CR)的患者可以选择终止治疗,并继续所有相关的研究评估(例如效能评估)。最少24周治疗后,肿瘤负荷评估为3次连续的肿瘤评价未发生变化的稳定(SD)疾病或部分反应(PR)的患者也可以选择终止治疗,并继续所有相关的研究评估(例如效能评估)。研究人群此研究的目标人群包括:不是标准治疗候选者、不愿意进行标准治疗或对其而言没有预期提供临床益处的可用治疗的晚期恶性肿瘤患者;及患有不可治愈的恶性肿瘤,且未能响应标准治疗或虽然进行了标准治疗但仍显示肿瘤进展的患者。选择标准:患者必须满足以下标准才有资格纳入研究:(1)显示实体瘤的进展,而没有替代的标准治疗选择可用;(2)至少1个用于反应评估的病灶。分配至放疗的患者需要有至少一个这样的附加病灶,该病灶在留出指数病灶的同时可安全地照射,且对该病灶而言认为按所考虑的有限的姑息剂量照射在医学上适当;(3)美国东部肿瘤协作组(ECOG)表现状况≤1;(4)年龄超过18岁;(5)肝功能:a.总胆红素≤1.5x正常上限(ULN;如果肝转移,则≤3xULN)、b.转氨酶≤3xULN(或≤5.0xULN,如果肝转移)、c.碱性磷酸酶(ALP)≤2.5xULN(或5.0xULN,如果肝转移);(6)肾功能:血清肌酸酐≤1.5xULN;(7)嗜中性粒细胞计数(ANC)≥1.5x109\/L、c.血小板计数≥75x109\/L;(8)有能力提供签署的知情同意书;和(9)有遵从预定就诊、治疗计划、化验和其他研究相关流程的能力和意愿。淘汰标准:满足任意以下标准的患者将从研究中排除:(1)目前或近期(5年内)有需要用全身免疫抑制治疗来治疗的明显自身免疫病的迹象,其可以提示irAE风险;(2)之前用阻断PD-1\/PD-L1途径的药物进行过治疗;(3)在第一剂mAb之前不到4周或4个半衰期(取较大者)内用其他免疫调节剂治疗过;(4)免疫调节剂的实例包括CTLA-4、4-1BB(CD137)、OX-40的阻断剂,治疗性疫苗,或细胞因子治疗;(5)可以认为具有活性的未经治疗的脑转移。之前治疗过脑转移的患者可以参加,只要它们稳定(即第一剂研究治疗之前至少4周未通过成像显示进展的迹象,且任何神经学症状已回至基线),且没有新的或扩大的脑转移的迹象;(6)第一剂mAb之前4周内接受过免疫抑制糖皮质激素剂量(>每天10mg强的松或等同剂量);(7)第一剂mAb之前6个月内出现过深静脉血栓、肺动脉栓塞(包括成像上鉴定出的无症状性肺动脉栓塞)或其他血栓性事件;(8)需要治疗的活性感染,包括已知的人免疫缺陷病毒感染,或乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的活性感染;(9)之前5年内有肺炎病史;(10)初次施用mAb之前30天内接受过任何研究性治疗或抗肿瘤治疗;(11)归因于用一般抗体治疗进行治疗或归因于明确用于本研究的治疗剂的有记录的变态反应或急性超敏反应病史;(12)已知对多西环素或四环素过敏(由于mAb中存在痕量成分而采取的预防措施);(13)哺乳;(14)血清妊娠试验阳性;(15)前5年内有除本研究中治疗的恶性肿瘤之外的浸润性恶性肿瘤病史,切除\/烧蚀的皮肤基底或鳞状细胞癌或宫颈原位癌、或认为通过局部治疗治愈的其他局部肿瘤除外;(16)在研究者的评价下,使得患者没有资格参加的急性或慢性精神问题;和(17)不愿意在研究期间适当避孕而继续性活动的有生育能力的男性或女性。研究治疗mAb将作为液体在无菌、一次性使用的小瓶中提供。每个小瓶将包含足以抽出10mL浓度为25mg\/mL的mAb的体积。关于剂量配制的说明在研究参考手册中提供。mAb将作为30分钟IV输注在门诊施用。每名患者的剂量将取决于个体体重。在每个体重变化≥10%的周期必须调整mAb的剂量。mAb将单独施用及与放疗和\/或环磷酰胺联合施用。单一治疗通过每14天IV输注30分钟来在门诊施用mAb48周(即56天周期的第1、15±3、29±3和43±3天)。计划的待分配的单一治疗方案可以包括:(i)每14天1mg\/kgIV输注30分钟,持续48周;(ii)每14天3mg\/kg输注30分钟,持续48周;(iii)每14天10mg\/kg输注30分钟,持续48周;和(iv)每14天0.3mg\/kg输注30分钟,持续48周(如果测定MTD低于1mg\/kg);联合治疗并存的放疗和环磷酰胺将通过处方提供,它们的用法、剂量、剂量改变、减少、或延迟、以及由它们的使用引起的任何潜在AE都将连同mAb的一起跟踪。mAb和放射的共同施用:mAb将与第8天至第12天的放疗联合,每14天IV输注30分钟,施用48周。计划的联合mAb和放疗方案可以包括:每14天1mg\/kgmAb输注30分钟,持续48周+30Gy放疗(6Gy×5次\/周;在第一剂mAb后1周提供,优选连续的天内提供);每14天1mg\/kgmAb输注30分钟,持续48周+27Gy放疗(9Gy×3次\/周;在第一剂mAb后1周提供,优选不连续的天内提供);每14天3mg\/kgmAb输注30分钟,持续48周+30Gy放疗(6Gy×5次\/周;在第一剂mAb后1周提供,优选连续的天内提供);每14天3mg\/kgmAb输注30分钟,持续48周+27Gy放疗(9Gy×3次\/周;在第一剂mAb后1周提供,优选不连续的天内提供)。患者将从第一剂mAb后1周开始接受作为每天施用6Gy的5份提供的30Gy,或从第一剂mAb后1周开始接受作为每隔一天施用9Gy的3份提供的27Gy。选择用于放射的病灶应是这样的病灶,该病灶在留出指数病灶的同时可用局部照射安全地照射,且对该病灶而言认为按所考虑的有限的姑息剂量照射在医学上适当。患者的目标剂量将基于群组分配,并符合正常组织需求量,与标准放射肿瘤学实践相一致。只有在满足正常组织标准时才允许按流程规定好的给药方案治疗。如果在流程中规定的任一个放疗方案下不能满足正常组织标准,则患者没有资格登记进入此研究的联合放疗群组。mAb和环磷酰胺的共同施用:mAb将与每14天200mg\/m2环磷酰胺的4个剂量组合,每14天(2周)IV输注30分钟,施用48周。4个环磷酰胺剂量中的每一个将在前4个mAb剂量中的每一个之前1天施用(第一个56天周期的第-1、14、28和42天)。虽然环磷酰胺已成功地与其他药物同时使用,但据报道,长期施用高剂量苯巴比妥使环磷酰胺的代谢速率和白细胞减少活性提高。环磷酰胺治疗导致胆碱酯酶活性的显著和持久的抑制,从而增强氯化琥珀酰胆碱的作用。计划的待分配的联合mAb和环磷酰胺方案是:每14天200mg\/m2环磷酰胺(第一个56天周期的第-1、14、28和42天)总计4个剂量;加上每14天3mg\/kgmAb输注30分钟,持续48周(如果3mg\/kg的单一治疗剂量<MTD;如果3mg\/kg>MTD,则剂量将为1mg\/kg)。mAb、放射和环磷酰胺的共同施用:计划的联合mAb、放射和环磷酰胺方案包括:每14天200mg\/m2环磷酰胺(第一个56天周期的第-1、14、28和42天)总计4个剂量;加上27Gy放疗(9Gy×3次\/周;在第一剂mAb后1周提供,优选不连续的天提供);或30Gy放疗(6Gy×5次\/周;在第一剂mAb后1周提供,优选连续的天提供);加上每14天3mg\/kgmAb输注30分钟,持续48周(如果3mg\/kg的单一治疗剂量<MTD;如果3mg\/kg>MTD,则剂量将为1mg\/kg)。研究变量主要变量:主要安全性变量包括48周治疗中的DLT发生率、治疗后出现的不良事件(TEAE)的发生率和严重度,及异常实验室发现。次要变量:关键次要变量包括以下:mAb的血清浓度和药代动力学(PK);用该适应症的适用标准评估的抗肿瘤活性:通过计算层析X射线照相术(CT)或磁共振成像(MRI)测量的实体瘤反应评价标准(RECIST)标准;对于其中RECIST测量不是标准的具体肿瘤,也可以使用其他评估标准;适用于RECIST测量结果的免疫相关反应标准(irRC);在所有情况下,irRC将是确定疾病进展(PD)、SD、CR或PR的管理工具。为了信息的目的,也将收集标准RECIST数据。抗mAb抗体研究流程为了确定研究资格或表征基线人群的目的,将在筛查时进行以下流程:(i)血清β-HCG(结果必须是第一个剂量前≤72小时);(ii)收集存档的肿瘤材料:患者提供知情同意书后,将要求患者安排提供之前收集的任何可用的肿瘤样品;(iii)脑MRI:如果在之前60天内未进行过,则筛查时需要进行脑MRI;和(iv)胸部x线透视:如果在之前60天内未进行过,则筛查时需要进行胸部x线透视。效能流程:在筛查就诊(输注前28天内)时、在每个周期(约每8周)的第56±3天、及在怀疑疾病进展时,将进行用于肿瘤评估的CT或MRI。此外,对于研究中未进展的患者,肿瘤评估将在随访就诊3、5和7进行。一旦选择使用CT扫描或MRI,则后续评估将用相同的方式进行。肿瘤反应评价将按照免疫相关反应标准(irRC;Nishino2013)进行。还将按照实体瘤反应评价标准(RECIST)1.1版(Eisenhauer2009)进行评估作为支持性探索;但是,个体患者疾病进展的初步确定将按照irRC进行。还将包括选择作为RECIST评估靶病灶的可测量病灶作为irRC评估的指数病灶。安全性流程:将收集生命体征,包括体温、安静血压、脉搏和呼吸。在与其他流程安排在同一次就诊时,应在临床实验室评估、PK或探索性样品收集之前测量生命体征。在周期1期间,在治疗日治疗前、在输注结束时、输注后前4个小时中每30分钟、及在研究药物施用后6和8小时,将记录生命体征。在后续周期中,输注前、前2小时中每30分钟、然后每小时直至研究药物施用后4小时,将评估和记录治疗日的生命体征。就诊时将进行全面或有限体检。全面体检将包括皮肤、头、眼、鼻、喉、颈、关节、肺、心脏、脉搏、腹部(包括肝和脾)、淋巴结和手足的检查,以及简单的神经检查。有限体检将包括肺、心脏、腹部和皮肤。将进行标准12导联ECG。研究者判断为与基线值相比是临床上显著的变化(恶化)的任何ECG发现都将视为AE,记录,并监测。免疫安全性测定包括类风湿因子(RF)、促甲状腺素(TSH)、C反应蛋白(CRP)及抗核抗体(ANA)效价和模式。在研究过程中,如果观察到RF或ANA从基线提高4倍或更多或异常的TSH或CRP水平,则还可以进行以下测试:抗DNA抗体、抗干燥综合征A抗原(SSA)抗体(Ro)、抗干燥综合征B抗原(SSB)抗体(La)、抗甲状腺球蛋白抗体、抗LKM抗体、抗磷脂抗体、抗胰岛细胞抗体、抗嗜中性粒细胞胞质抗体、C3、C4、CH50。活化部分凝血活酶时间(aPTT)和国际标准化比值(INR)将在研究地点当地的实验室分析。安全性不良事件(AE)是施用研究药物的患者中的任何不良医学事件,其与研究药物可以具有或不具有因果关系。因此,AE是在时间上与研究药物的使用相关的任何不利和无意的病征(包括异常实验室发现)、症状或疾病,无论是否认为其与研究药物相关。AE还包括现有病症在时间上与研究药物的使用相关的任何恶化(即频率和\/或强度的任何临床上显著的变化)。如果它与潜在癌症的典型进展模式(包括时程、累及器官等)明显一致,则潜在恶性肿瘤的进展将不视为AE。如果症状不能确定为完全由潜在恶性肿瘤的进展引起,或者不符合所研究的疾病的预期进展模式,则可将进展的临床症状报告为AE。严重不良事件(SAE)是在任何剂量下导致死亡、危及生命、需要住院治疗或延长现在的住院、导致永久或显著的残疾\/失能(进行正常生活功能的能力的实质性破坏)、是先天性异常\/出生缺陷的任何不良医学事件。将记录所有AE和SAE的患者信息。统计计划研究剂量递增基于每个剂量水平分配3至6名患者的传统3+3设计。登记进入研究的患者的确切数量将取决于所观察到的流程中定义的DLT的数目,及扩大目前确定的剂量水平或开放更低剂量水平的附加群组的需要。剂量递增中所需的下一个群组的首次入组发生后,低于该治疗MTD的之前每个群组的入组将扩大(如果之前未在递增过程中扩大)至总计6名患者。数据将仅用描述统计学总结。通常,数据将按剂量水平和联合总结。将对安全性分析集(SAF)进行安全性总结和分析。初步安全性分析将基于治疗后出现的AE(TEAE)。本发明的范围不限于本文所述的具体实施方案。实际上,对本领域技术人员而言,除本文所述的那些之外,本发明的多种修改将从之前的描述和附图变得显而易见。这类修改旨在落在所附权利要求的范围之内。
 
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